Name: تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: استكشف تقنية تشريح وتركيب أجنة أسماك الزرد لدراسة تطور الحبل الشوكي. تُمكّن هذه الطريقة من تصوير أجسام الخلايا بعد الانقسام ومسارات المحاور العصبية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بتمويل سكيدمور كلية المنح الإنمائية في إعداد ونشر هذه المخطوطة.

1. تصاعد الأجنة (عند الانتهاء من اختيار تقنيات التصور، مثل كيمياء سيتولوجية مناعية، التهجين في الموقع، الخ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في طبق بيتري 35 ملم مليئة العازلة في الاختيار (الشكل 1A). ويستند اختيار عازلة على الإجراء وضع العلامات. عادة مخازن تستند PBS-مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط، وتأمين الرأس مع زوج واحد من ملقط حين سحب صفار البيض بعيدا مع الزوج الآخر (الشكل 1B). بدلا من ذلك، استخدم دبوس الحشرات في حامل دبوس الحشرات لسحب بلطف بعيدا صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الجنين لعبة البوكر (صيد الانترنت (0.41 مم) لصقها على أي أنبوب شعري أو ماصة باستور) نقل الأجنة إلى جزء من طبق بيتري الذي ليس لديه الكثير من الحطام صفار (أرقام 1C-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستير الزجاج، ونضح الأجنة في السائل أقل قدر ممكن، وزماصة مستديم لهم على شريحة (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفتيل بلطف بعيدا السائل الزائد باستخدام مختبر مسح. تجنب الاتصال مع الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة إلى الأجنة. للتسميات الفلورسنت، واستخدام كاشف antifade الاختيار. للإشارات اللونية، 70٪ الجلسرين يمكن استخدامها كوسيلة في تصاعد مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام لعبة البوكر الجنين، توجيه الأجنة على الجانبين في الصفوف (الشكل 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة &quot;الداب&quot; واحدة من الفازلين أو الشحوم عالية فراغ إلى كل ركن من أركان ساترة (الشكل 1G). هذا يمنع الضرر من الجنين من الضغط المفرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة (الجانب الفازلين لأسفل) على رأس الأجنة (الشكل 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف اضغط على ساترة في كل زاوية حتى وسائل الإعلام تركيب (70٪ الجلسرين أو مكافحة تتلاشى كاشف التركيب) لمس ساترة (الشكل 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من وسائل الإعلام المتصاعدة من قبل pipetting بجوار COVerslip، باستخدام pipettor في نطاق 20-200 مل. سيكون الفتيل تحت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مختبر مسح ونظيفة تماما حول ساترة. تكون على يقين من أن يتم تطبيق الضغط على ساترة، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الأجنة. يجب أن تكون هذه المنطقة جافة وليس لها أي الفازلين أو وسائل الإعلام تصاعد على ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طلاء الأظافر لختم حول حافة ساترة (الشكل 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

لا توجد المصالح المالية المتنافسة لأي كاتب.

تصاعد الأجنة الزرد الوحشي للمساعدات التصور ثابتة للتنمية الحبل الشوكي. من خلال إزالة الكرة صفار، يتم تقليل مسافة العمل المطلوبة للتصوير مجهرية استثنائية. تم نتائجنا ممثل تقتصر على المرحلة 24 HPF، ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها في وقت مبكر من 18 HPF، على الرغم من الأجنة في وقت سابق أكثر صعوبة لتشريح بسبب حجم الجنين وهشاشة النسيج. هذا الأسلوب ينطبق على الأجنة أقدم من 24 HPF أيضا. وبمساعدة من وضوح بصري من الزرد الجنينية، والقدرة على أداء شاشات الوراثية إلى الأمام، وعلم الوراثة العكسية، والنهج المعدلة وراثيا، قد يتم التحقيق العديد من العمليات التنموية. وهذا يشمل مؤشرات الإنقسامية من الأسلاف العصبية مع علامات مثل BrdU ومكافحة الفوسفات-هيستون 4-6 مارس والزخرفة من خلال التعبير عن علامات العصبية والدبقية السلف في باكس، nkx، DBX، وolig familieو 1،4-6. الكواشف أن تقرير تقرير الدبقية والخلايا العصبية (مثل الدبقية البروتين حمض ييفي (GFAP) وHUC / D) 1،4،5،10 يمكن استخدامها. ويمكن تحليل الخلايا العصبية سلالة التمايز من خلال التعبير عن جزيرة، VSX، معكوسة، والجينات غاتا 1،4-6. وأخيرا، وتحليل توجيهات محوار هو ممكن من خلال الأجسام المضادة مثل تويولين مكافحة الأسيتيل، 3A10، وznp-1 2،11،12. على الرغم تستخدم أنظمة نموذج الفقاريات الأخرى (الماوس وفرخ) لدراسة تطور الحبل الشوكي، إلا أن تصاريح الزرد عرض في وقت واحد من جميع المحاور التنموية في الجنين سليمة. القيد واضحة لهذا النهج هو أن الأجنة يتم إصلاحها، والذي يحول دون التصوير الحي. في الواقع، وإزالة (أو تلف) نتائج صفار في الموت السريع الجنينية، وبالتالي فإنه ليس من الممكن للحد من مسافة العمل في الأجنة الحية باستخدام هذه التقنية. ومع ذلك، تضخم عالية شارك في العمود الفقريالتصوير الثالثة في الأجنة الحية هو ممكن. من أجل الحفاظ على صفار خلال التصوير الحي والأجنة يمكن وضعها في الشرائح الاكتئاب، والتي توفر مساحة أكبر بين العينة وساترة. بدلا من ذلك، العديد من 22 ملم × 22 ملم coverslips ويمكن لصقها على أي شريحة من 3 × 1 في في الشريحة المجهرية. لل coverslips بمثابة &quot;جسر&quot; لساترة الفوقية. إذا الأجنة تكون أقدم من 18 HPF، ويستخدم لتخدير تريكين الأجنة لمنع الحركة. في حين أن المسافة عمل 0.288 مم مطلوب للأجنة deyolked في 24 HPF، عند العمل مع الأجنة الحية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز، مع صفار سليمة، عدسة مجهرية مع مسافة العمل 3.3 مم كافية. بدلا من ذلك، الثقافات ازدراع المستمدة من الأجنة deyolked يمكن تصور باستخدام البلازما جلطة الشلل تقنية 13. ويمكن ملاحظة السكان مختلفة من الخلايا من خلال استخدام البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا مثل GFP، mCherry، أو photoconصبغ vertible Kaede الذي (على سبيل المثال لا الحصر). علاوة على ذلك، الخلايا fluorescently المسمى داخل أجنة خيالية ويمكن أيضا أن ينظر إليها مع هذا النهج 14. وهناك تقنية تصاعد متسقة ومستقرة لعدة أشهر هو أداة حاسمة لعلماء البيولوجيا التطورية والخلية. هذه التقنية هي واضحة قابلة للتكرار، مما يتيح المقارنة سهلة بين التجارب التجريبية المختلفة. علاوة على ذلك، محاذاة الأجنة في الصفوف يسمح بسهولة تحديد الأجنة محددة لتحليلها لاحقا.

هو تحول دون تصور من الحبل الشوكي في الزرد من قبل عدد من العوامل. نظرا لسمك و somites المغطي وموقع الداخلية من الحبل الشوكي، مطلوب مسافة طويلة في العمل إلى حد كبير لقرار الخلوية عالية. الكرة صفار (الذي لا يزال حاضرا خلال المراحل الأولى من تكوين الخلايا العصبية) يزيد من مسافة العمل المطلوبة، وتلف بسهولة عن طريق الضغط من ساترة. بالإضافة إلى ذلك، الحطام من صفار التالفة يحظر التصور واضحة من الأنسجة. على الرغم من المقاطع العرضية في (DV) محور ظهراني بطني ممكنة، فإنها لا تسمح بسهولة تصور في وقت واحد في الأمامي الخلفي (ا ف ب) المحور 1. للتغلب على هذه العقبات، يتم تشريح الأجنة والتي شنت على الشرائح. يوفر هذا الإجراء العديد من الفوائد. الأولى، تكمن بسهولة الأجنة الزرد مع الجانب الوحشي متجهة لأعلى، مما يسهل AP محور التصور. ثانيا، إزالة بال صفارل يقلل من مسافة العمل المطلوبة، ويحد من الحطام. الثالثة، هذا الإجراء تصاعد يسمح لكلا الفلورسنت وbrightfield المجهري. الرابع والأجنة التي شنت في حالة مستقرة لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية، مما يسمح العينة لفترة طويلة التصور. أخيرا، تقدم التنمية يحدث في تلك القطاعات الأمامية هي أكثر نضجا من شرائح الخلفي. من أجل ضمان أن تتم مقارنة نظموا hemisegments الشوكي المتطابقة بين الأجنة، يتم استخدام المغطي الأنسجة الجسيدة كدليل. على سبيل المثال، في العاشر الجسيدة معظم الخلفي يعتلي hemisegment الشوكي العاشرة، وهو ما يعادل تنمويا في الأجنة المتطابقة المرحلة. هذا الإجراء المتصاعدة للأجنة سليمة تتيح سهولة تحديد somites. نستخدم علم الوراثة والجينات تقنيات تدق إلى أسفل لدراسة آليات التوجيه محوار في الحبل الشوكي النامي. على وجه الخصوص، فقد قررنا أن robo2، robo3، وDCC مطلوبة من أجل صواري ASCE الابتدائيةnding (كوبا) محوار الاستطلاعية. باستخدام الإجراء تصاعد وصفها هنا، كنا قادرين على دراسة النمو بطني، عبور خط الوسط، عرض الصوار، والظهرية 2،3 النمو الأمامي. ويمكن أيضا أن يطبق هذا الإجراء إلى تصاعد DV أو AP الزخرفة من الحبل الشوكي. وقد استخدمنا هذا الإجراء لتحديد الأدوار المتباينة من المستجيبات WNT المصب في DV الزخرفة من الحبل الشوكي. استخدام هذا التركيب، تمكنا من الحصول على قرار من علامات DV على مستوى خلية واحدة، وتحديد التحولات الزخرفة دقيقة نتيجة لتغير استقبال إشارة WNT 4،5. يسمح هذا الإجراء تصاعد أيضا لحساب مؤشر الإنقسامية من خلال مكافحة phosphohistone 3 أو وضع العلامات BrdU (انتشار السلف) التمايز 5.

<table><tbody><tr><td>< ص>أطباق بتري 35 مم × 10 مم < / ص ></td> <td>VWR</td> < <td>ص > 25373-041 < / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > ملقط دومون # 3 < / ص > فيشر </td><td>العلمية</td> <td>< ص >NC9839169< / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > غطاء الزجاج < / ص > </td><td>فيشر العلمي</td> <td>< ص > 12-541-B22X22-1.5 </td><td></td></tr><tr><td> < ص > الشرائح< / ص > </td><td>فيشر العلمي</td> <td>< ص>12-550-343< / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > SlowFade Gold </td><td>فيشر العلمي</td> <td>< ص > S36936 < / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td> <td> P36934 </td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td>أي محل بقالة</td> <td>< ص > < / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > حاملي الحلقة < / ص > </td><td>VWR</td><td>< ص > 80094-482 < / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > دبابيس الحشرات < / ص > </td><td>أدوات العلوم</td> <td>الدقيقة < ص > 26002-10 < / ص ></td><td></td></tr><tr><td> < ص > حاملات دبوس مطلي بالنيكل < / ص > </td><td>أدوات العلوم</td> <td>الدقيقة < ص > 26016-12 < / ص > < ص > < / <ص</td><td></td> ></tr> <tr><td>ص > أوليمبوس المجهر التجسيمي < / ص ></td> <td>أوليمبوس</td> <td>< ص > SZ61 < / ص ></td><td></td></tr></tbody></table>

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

الحبل الشوكي الزرد هو نموذج التحقيق الفعال للأبحاث الجهاز العصبي لعدة أسباب. الأولى، الوراثية، والجينات المعدلة وراثيا النهج ضربة قاضية يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير النظام العصبي. الثانية، براثن كبير من الأجنة متزامنة تنمويا توفير أحجام العينة التجريبية الكبيرة. الثالث، وضوح بصرية للجنين الزرد يسمح للباحثين لتصور السلف، الدبقية، والسكان العصبية. على الرغم من أن الأجنة الزرد شفافة، يمكن أن سماكة العينة تعيق التصور المجهرية فعالة. أحد الأسباب لذلك هو تطوير جنبا إلى جنب من الحبل الشوكي والأنسجة الجسيدة الفوقية. سبب آخر هو الكرة صفار الكبيرة، والتي لا تزال موجودة خلال فترات تكوين الخلايا العصبية في وقت مبكر. في هذه المقالة، ونحن لشرح تسليخ مجهري وإزالة صفار في الأجنة الثابتة، الذي يسمح التصور المجهري مع الحفاظ على الأنسجة المحيطة الجسيدة. نحن المرضس تثبت تصاعد شبه دائمة من الأجنة الزرد. هذا يسمح مراقبة النمو العصبي في المحاور ظهراني بطني والأمامي الخلفي، كما أنه يحافظ على أبعاد ثلاثة من الأنسجة.

عندما توضيح الآليات التي تكمن وراء الأحداث التنموية المختلفة مثل الزخرفة الخلوية، والتمايز، والتوجيه محور عصبي، فإنه من المهم أن تكون قادرا على تصور الخلايا في سياق أنسجتهم. العيوب الزخرفة ظهري بطني الحاضر وعادة ما تحول بطني أو ظهري في مجال التعبير عن عوامل النسخ في باكس، nkx، أو الأسر DBX 4. في بعض الأحيان، قد تكون التغييرات الطفيفة، التي تضم سوى عدد قليل من أقطار الخلية 4. تحليل مقطعية يسمح هذا النوع من التحليل. ومع ذلك، يمكن الكواشف مع إشارات أضعف، أو المقاطع العرضية التي ليست عمودي على محور AP لحد من التفسير. علاوة على ذلك، تحليل مقطعية لا يأخذ بعين الاعتبار بسهولة ما إذا كانت التغييرات لا تزال قائمة في محور AP، ويعتمد على توافر ناظم البرد. يتم التحايل على هذا التحديد من قبل وجهات النظر الجانبي للحبل الشوكي. كما رأينا في الشكل 2B، nkx6.1 مرنا هو دistributed في ما يقرب من النصف بطني من الحبل الشوكي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، ضمن المجال السلف. الخلايا الاصلية يمكن تمييزها من الخلايا الإنقسامية آخر بسبب وجود لوحة الكلمة، التي وجدت في الجزء الأنسي من الحبل الشوكي. شوهدت مع عدسات مدينة دبي للإنترنت، والخلايا الفردية بشكل واضح للتمييز، وحدود المعرفة بين التعبير عن وnonexpressing الخلايا هو واضح. ويرافق دورة الخلية السلف الخروج عن التغيرات في التعبير الجيني. على سبيل المثال، كل الخلايا العصبية بعد الإنقسامية التعبير عن HUC / D الذي هو كشفها مع كيمياء سيتولوجية مناعية 1،5. تحقيقات مرنا للجزيرة، غاتا، والأسر VSX تسمية الخلايا العصبية بعد الإنقسامية محددة من الموقف الثابت وعدد داخل كل hemisegment الحبل الشوكي 6. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن مستقبلات التوجيه محور عصبي مثل تلك التي في الأسرة روبو في السكان المقيد من الخلايا العصبية تالية للتفتل (الشكل 2C) <suع&gt; 2،7،8. تصاعد الوحشي للأجنة يسمح التهم دقيقة من الخلايا العصبية بعد الإنقسامية. وبالمثل، الأسلاف التي لا تزال تقسم يمكن قياسها كميا مع مكافحة الفوسفات هيستون-3 كيمياء سيتولوجية مناعية وكذلك وضع العلامات BrdU. علاوة على ذلك، يمكن تقييم موت الخلايا مع وضع العلامات النفق 4-6. في 24 HPF، محاور عصبية من الخلايا العصبية تالية للتفتل التالية يمكن تصور مع أساليب مختلفة، ويمكن تمييزها على مستوى خلية واحدة: الظهرية الجانبي تصاعدي (دولا)، صواري تصاعديا الابتدائية (كوبا)، صواري الثانوية تصاعدي (كوسا)، بطني الطولية تنازليا (واحة)، كولمر-Agdur (KA)، صواري Bifurcating / الطولية (الكوز / L)، محيطي تصاعدي (سي آي ايه)، محيطي تنازليا (CID)، وأحادي القطب صواري تنازليا (UCoD)، روهون حية (RB)، العصبونات الحركية ( M) 9. تمديد المحاور من هذه الخلايا العصبية في ظهري، بطني، الأمامي، والخلفي الاتجاهات. أنها فرع، عبور خط الوسط، والخروج على حد سواء ظهريوالحبل الشوكي بطني. عندما يقترن متحد البؤر المسح المجهري بالليزر، هذه السلوكيات الخلوية المتنوعة واضحة في الأجنة التي شنت أفقيا، وذلك باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية والبروتينات الفلورية المرمزة وراثيا مثل GFP 2. في الشكل 2D، تم استخدام znp-1 كيمياء سيتولوجية مناعية لتسمية العصبونات الحركية النامية. العصبونات الحركية الخروج من الحبل الشوكي البطني للعصب العضلات النامية المحيطة بها. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> الشكل 1. تشريح والجانبية جبل الأجنة الزرد. (A) وبعد تجهيز المناعي، الموقع التهجين الموجودين في، وتوضع الأجنة في طبق بيتري 35 ملم مليئة PBT (PBS مع 0.5٪ تريتون X-100) أو استخدام محطة (PBS مع 0.1٪ توين 20). صفارالكرة (YB) هو واضح. (ب) تتم إزالة صفار من خلال تأمين رأس الجنين تليها تشريح دقيق. (C) يتم استخدام لعبة البوكر الجنين (صيد الانترنت لصقها على ماصة باستور) لأجنة منفصلة والحطام صفار (D). و pipetted الأجنة تنظيفها على شريحة المجهر (E) والانحياز (F). يتم تطبيق هلام (G) للبترول لزوايا ساترة. (H) يتم وضع ساترة بلطف على أعلى من الأجنة في تصاعد المتوسط. يستخدم البولندية (I) الأظافر لختم حواف ساترة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> قوية الشكل 2&gt;. تحليل الجينات وأنماط التعبير محوار الاستطلاعية التي شنت أفقيا في الأجنة الزرد. (A) رسم لجنين الزرد في 24 HPF. في دينار بحريني، وتصور ما يقرب من أربعة hemisegments أعلاه تمديد الكيس المحي (منطقة محاصر). (ب) يتم التعبير عن nkx6.1 في الحبل الشوكي بطني، بما في ذلك الكلمة لوحة (FP). وأعرب عن (C) robo3 في الخلايا العصبية تالية للتفتل (السوداء). منطقة لوحة الكلمة والسلف ليس واضحا في هذا المستوى البؤري أكثر الجانبي. في B، C، يحدها الحبل الشوكي لفئة على الجانب الأيسر من الصورة. وقد استخدم (D) متحد البؤر المجهري لصورة znp-1 المناعي، التي تصف المحاور الحركية التي تخرج من النخاع الشوكي البطني. في جميع الصور، هو الأمامي إلى اليسار والظهرية متروك. A 40X مسافة العمل الطويلة، تم استخدام الغمر بالماء (NA 0.8) عدسة (3.3 ملم).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

العمليات التنموية مثل الانتشار، الزخرفة، والتمايز، والتوجيه محوار يمكن أن تكون على غرار بسهولة في الحبل الشوكي الزرد. في هذه المقالة، ونحن تصف الإجراء لتصاعد الأجنة الزرد، الذي يحسن التصور لهذه الأحداث.

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح وأثبيت أجنة سمك الزيبرا (zebrafish) لتحقيق الرؤية المجهرية المثلى للنخاع الشوكي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التشريح المجهري وإزالة الكرة البيضية. وتتمثل الخطوة الثانية في إزالة بقايا البيض ونقل الأجنة باستخدام الماصة إلى شريحة مجهرية.بعد ذلك، يتم إزالة السائل الزائد بعناية باستخدام منديل Kim wipe، يليه إضافة وسط التثبيت. وتتمثل الخطوة النهائية في توجيه الأجنة على الشريحة باستخدام أداة تحريك الأجنة (embryo poker) ثم وضع غطاء الشريحة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري أو المجهر ذو المجال المضيء لإظهار توزيع أجسام الخلايا ما بعد الانقسامية ومسار المحاور العصبية النامية.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الأحياء العصبي، مثل الآليات المسؤولة عن التنميط، والتمايز، وتوجيه المحاور العصبية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول العديد من جوانب تطور الجهاز العصبي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنسجة أخرى مثل العضلات النامية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لأنها تتطلب إجراء عملية التشريح تحت المجهر قبل البدء في التجربة.قم بصنع أداة وخز الأجنة عن طريق لصق طرف ماصة بماصة سابقة، ثم لصق خيط صيد بطرف الماصة. لبدء عملية تشريح الأجنة، ضع ما يصل إلى 30 جنيناً من أسماك zebrafish، بعمر 24 ساعة بعد الإخصاب، في طبق بتري بقطر 35 مليمتر مملوء بـ PBS.باستخدام مجهر تشريحي، ثبّت رأس الجنين بملقط بينما تسحب المحّ بعيداً باستخدام دبوس حشري. ثم استخدم أداة تحريك الأجنة لنقل الأجنة إلى جزء من طبق بتري لا يحتوي على الكثير من بقايا المحّ. بعد ذلك، قم بشفط الأجنة باستخدام ماصة بستور زجاجية مع سحب أقل قدر ممكن من السائل.ثم قم بنقل ما يصل إلى 21 جنيناً بلطف باستخدام الماصة إلى شريحة. اسحب السائل الزائد بعناية باستخدام منديل مختبري مع تجنب لمس الأجنة، ثم أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت إلى الأجنة. بعد ذلك، استخدم أداة تحريك الأجنة لتوجيه الأجنة على جوانبها في صفين إلى ثلاثة صفوف.الآن، ضع كمية صغيرة من الفازلين على كل زاوية من زوايا شريحة التغطية. أدر شريحة التغطية بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الفازلين متجهاً للأسفل، ثم ضع شريحة التغطية فوق الأجنة. يعمل الفازلين على منع تضرر الأجنة الناتج عن الضغط المفرط.انقر برفق على أركان غطاء الشريحة حتى يلامس وسط التثبيت غطاء الشريحة إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام ماصة في نطاق 20 إلى 100 µL. أضف المزيد من وسط التثبيت بجانب غطاء الشريحة واترك الوسط المضاف يتسرب تحت الغطاء. الآن، استخدم مناديل مختبرية لتنظيف المنطقة المحيطة بغطاء الشريحة تماماً.لا تضغط على غطاء الشريحة لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأجنة؛ وعندما يتم التنظيف بشكل صحيح، تكون المنطقة جافة وخالية من الفازلين أو وسائط التثبيت. انتهِ باستخدام طلاء الأظافر لإغلاق الحواف المحيطة بغطاء الشريحة. بعد تثبيت أجنة zebrafish، تمت معاينة عدة قطع HEMI فوق امتداد الكيس الصفاقي.يوضح هذا الشكل تعبير NK X 6.1 في الحبل الشوكي البطني لجنين سمكة الزيبرفيش. يتوزع mRNA الخاص بـ NK X 6.1 تقريبًا في النصف البطني من الحبل الشوكي بعد 24 ساعة من الإخصاب. وضمن نطاق الخلايا السلفية، يمكن تمييز الخلايا السلفية عن الخلايا ما بعد الانقسامية بسبب وجود الصفيحة الأرضية، التي توجد في الجزء الإنسي من الحبل الشوكي.تمت المشاهدة باستخدام بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC). يمكن تمييز الخلايا الفردية بوضوح، ويظهر حد فاصل محدد بين الخلايا التي تعبر عن الجين والخلايا التي لا تعبر عنه. يصاحب خروج الخلايا السلفية من الدورة الخلوية تغيرات في التعبير الجيني.تظهر هذه الصورة تعبير robo three في العصبونات ما بعد الانقسامية. تُعد عائلة مستقبلات robo من مستقبلات توجيه المحاور العصبية التي يسمح تعبيرها بإجراء عد دقيق للعصبونات ما بعد الانقسامية. يلاحظ أن الصفيحة الأرضية ومنطقة الخلايا السلفية غير ظاهرتين في هذا المستوى البؤري الأكثر جانبية.استُخدم المجهر البؤري (Confocal microscopy) لتصوير الفلورة المناعية لبروتين znp one، والذي يحدد المحاور العصبية الحركية كما هو موضح في هذا الجنين المثبت جانبياً. تخرج العصبونات الحركية من الحبل الشوكي بطنياً بعد 24 ساعة من الإخصاب لتعصيب العضلات النامية المحيطة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 30 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على سلامة الأنسجة من خلال التشريح المجهري الدقيق. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات التشريح المجهري لإزالة مح yolk من أجنة zebrafish من أجل التثبيت والتصور المجهري.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بعد الإصابة، وحركة C-منحنى قبل 3 أيام بعد الإصابة.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تطوير الجهاز في الأجنة الزرد باستخدام مضان تشريح المجهر قادرة على أداء باجتزاء البصرية واستراتيجيات بسيطة من التعديل لتصحيح الانحراف البؤري ومستو.

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

هنا ، نقدم طريقة تركيب متعددة الاستخدامات تسمح بالتصوير بفاصل زمني طويل الأمد لنمو الجسم الخلفي لأجنة أسماك الزرد الحية دون الإخلال بالتطور الطبيعي.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

توضح هذه المخطوطة طرق التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية في العمود الفقري من الأجنة الزرد واليرقات. إعداد يحافظ على الخلايا العصبية في الموقع وغالبا ما ينطوي على الحد الأدنى تشريح. تسمح هذه الطرق لدراسة الكهربية من مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية في العمود الفقري، من الأولي للاكتساب استثارة الكهربائية من خلال مراحل اليرقات في وقت مبكر.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

وهنا، فإننا نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة ناصف العين متفوقة، بنية حددت مؤخرا، وحفظت تقحم في عين الفقاريات. استخدام اليرقات الزرد، علينا أن نظهر التقنيات اللازمة لتحديد العوامل التي تسهم في تشكيل وإغلاق ناصف العين متفوقة.

التصور "ناصف العين العليا" خلال Embryogenesis ريريو دانيو

هنا ، نقوم بوصف طريقه للحد من حجم الاجنه الزبرده دون تعطيل العمليات التنموية الطبيعية. تمكن هذه التقنية من دراسة قياس النمط ومتانة النمو ضد تغيير الحجم.

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

هنا، نقدم بروتوكول زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد لمحور الجسم الخلفي لسمك الحمار الوحشي، مما يتيح الدراسة الحية للتجزئة الفقارية. يوفر هذا النموذج explant السيطرة على استطالة المحور، وتغيير مصادر مورفوجين، والتصوير الحي على مستوى الأنسجة دون الخلوية.

ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي

هنا ، نقدم طريقة لمحاذاة وتقطيع عينات يرقات متعددة من الزرد (Danio rerio) وجمعها على شريحة واحدة لتحليل النسخ المكاني.

الترتيب المضغوط مكانيا لأقسام اليرقات الزرد لتحليل النسخ المكاني

استكشف تقنية تشريح وتركيب أجنة أسماك الزرد لدراسة تطور الحبل الشوكي. تُمكّن هذه الطريقة من تصوير أجسام الخلايا بعد الانقسام ومسارات المحاور العصبية بدقة عالية.

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

استكشف المزيد من الفيديوهات