تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح وأثبيت أجنة سمك الزيبرا (zebrafish) لتحقيق الرؤية المجهرية المثلى للنخاع الشوكي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التشريح المجهري وإزالة الكرة البيضية. وتتمثل الخطوة الثانية في إزالة بقايا البيض ونقل الأجنة باستخدام الماصة إلى شريحة مجهرية.

بعد ذلك، يتم إزالة السائل الزائد بعناية باستخدام منديل Kim wipe، يليه إضافة وسط التثبيت. وتتمثل الخطوة النهائية في توجيه الأجنة على الشريحة باستخدام أداة تحريك الأجنة (embryo poker) ثم وضع غطاء الشريحة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري أو المجهر ذو المجال المضيء لإظهار توزيع أجسام الخلايا ما بعد الانقسامية ومسار المحاور العصبية النامية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الأحياء العصبي، مثل الآليات المسؤولة عن التنميط، والتمايز، وتوجيه المحاور العصبية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول العديد من جوانب تطور الجهاز العصبي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنسجة أخرى مثل العضلات النامية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لأنها تتطلب إجراء عملية التشريح تحت المجهر قبل البدء في التجربة.

قم بصنع أداة وخز الأجنة عن طريق لصق طرف ماصة بماصة سابقة، ثم لصق خيط صيد بطرف الماصة. لبدء عملية تشريح الأجنة، ضع ما يصل إلى 30 جنيناً من أسماك zebrafish، بعمر 24 ساعة بعد الإخصاب، في طبق بتري بقطر 35 مليمتر مملوء بـ PBS.

باستخدام مجهر تشريحي، ثبّت رأس الجنين بملقط بينما تسحب المحّ بعيداً باستخدام دبوس حشري. ثم استخدم أداة تحريك الأجنة لنقل الأجنة إلى جزء من طبق بتري لا يحتوي على الكثير من بقايا المحّ. بعد ذلك، قم بشفط الأجنة باستخدام ماصة بستور زجاجية مع سحب أقل قدر ممكن من السائل.

ثم قم بنقل ما يصل إلى 21 جنيناً بلطف باستخدام الماصة إلى شريحة. اسحب السائل الزائد بعناية باستخدام منديل مختبري مع تجنب لمس الأجنة، ثم أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت إلى الأجنة. بعد ذلك، استخدم أداة تحريك الأجنة لتوجيه الأجنة على جوانبها في صفين إلى ثلاثة صفوف.

الآن، ضع كمية صغيرة من الفازلين على كل زاوية من زوايا شريحة التغطية. أدر شريحة التغطية بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الفازلين متجهاً للأسفل، ثم ضع شريحة التغطية فوق الأجنة. يعمل الفازلين على منع تضرر الأجنة الناتج عن الضغط المفرط.

انقر برفق على أركان غطاء الشريحة حتى يلامس وسط التثبيت غطاء الشريحة إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام ماصة في نطاق 20 إلى 100 µL. أضف المزيد من وسط التثبيت بجانب غطاء الشريحة واترك الوسط المضاف يتسرب تحت الغطاء. الآن، استخدم مناديل مختبرية لتنظيف المنطقة المحيطة بغطاء الشريحة تماماً.

لا تضغط على غطاء الشريحة لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأجنة؛ وعندما يتم التنظيف بشكل صحيح، تكون المنطقة جافة وخالية من الفازلين أو وسائط التثبيت. انتهِ باستخدام طلاء الأظافر لإغلاق الحواف المحيطة بغطاء الشريحة. بعد تثبيت أجنة zebrafish، تمت معاينة عدة قطع HEMI فوق امتداد الكيس الصفاقي.

يوضح هذا الشكل تعبير NK X 6.1 في الحبل الشوكي البطني لجنين سمكة الزيبرفيش. يتوزع mRNA الخاص بـ NK X 6.1 تقريبًا في النصف البطني من الحبل الشوكي بعد 24 ساعة من الإخصاب. وضمن نطاق الخلايا السلفية، يمكن تمييز الخلايا السلفية عن الخلايا ما بعد الانقسامية بسبب وجود الصفيحة الأرضية، التي توجد في الجزء الإنسي من الحبل الشوكي.

تمت المشاهدة باستخدام بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC). يمكن تمييز الخلايا الفردية بوضوح، ويظهر حد فاصل محدد بين الخلايا التي تعبر عن الجين والخلايا التي لا تعبر عنه. يصاحب خروج الخلايا السلفية من الدورة الخلوية تغيرات في التعبير الجيني.

تظهر هذه الصورة تعبير robo three في العصبونات ما بعد الانقسامية. تُعد عائلة مستقبلات robo من مستقبلات توجيه المحاور العصبية التي يسمح تعبيرها بإجراء عد دقيق للعصبونات ما بعد الانقسامية. يلاحظ أن الصفيحة الأرضية ومنطقة الخلايا السلفية غير ظاهرتين في هذا المستوى البؤري الأكثر جانبية.

استُخدم المجهر البؤري (Confocal microscopy) لتصوير الفلورة المناعية لبروتين znp one، والذي يحدد المحاور العصبية الحركية كما هو موضح في هذا الجنين المثبت جانبياً. تخرج العصبونات الحركية من الحبل الشوكي بطنياً بعد 24 ساعة من الإخصاب لتعصيب العضلات النامية المحيطة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 30 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على سلامة الأنسجة من خلال التشريح المجهري الدقيق. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات التشريح المجهري لإزالة مح yolk من أجنة zebrafish من أجل التثبيت والتصور المجهري.