Name: مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: اكتشف مقايسة الهجرة الخلية الكمي لأسلاف العصبية المعوية في أجنة الفئران باستخدام شرائح الأمعاء الدقيقة والمجهر الضوئي. تساعد هذه الطريقة في فهم تكوين الجهاز العصبي المحيطي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر دينيس Flipo لمعالجة الصور وتحليلها وتقديم المشورة، وديفيد دبليو السيلفر في المختبر الذي تم إنشاء خط الماوس Gata4p [5KB]-GFP. ويتم تمويل البحوث في المختبر بيلون من قبل CIHR، NSERC، FRQS وFRQNT.

بيان الأخلاق وأجريت التجارب على الفئران التالية المجلس الكندي للرعاية الحيوان المبادئ التوجيهية لرعاية والتلاعب من الحيوانات المستخدمة في البحوث الطبية. تمت الموافقة على البروتوكولات التي تنطوي على التلاعب في الحيوانات من قبل لجنة الأخلاق المؤسسي للجامعة كيبيك في مونتريال (لجنة حماية Institutionnel دي دي Animaux؛ الرقم المرجعي 0512-R3-650-0513). 1. إعداد الهلام الكولاجين العمل بطريقة عقيمة، تحت غطاء زراعة الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاملة 5X DMEM (النسر تعديل الوسيلة الأساسية) بما في ذلك المضادات الحيوية القياسية. حل 3.37 غرام من مسحوق DMEM و0.925 غرام من NaHCO 3 في 20 مل من الماء. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون. إضافة 2.5 مل من العقيمة 100X البنسلين / الستربتوميسين و 25 مل من مصل بقري جنيني العقيمة للحرارة المعطل. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الجليد، ومزيج 800 ميكرولترمن الكولاجين أنا الحل (3.77 ملغ / مل في 0.02 N حامض الخليك، فلتر تعقيم)، 600 ميكرولتر من DMEM كاملة 5X و 17 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم N 1. تمييع مع الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 3 مل. وتشمل عوامل النمو ذات الصلة في هذا المزيج. نحن عادة استخدام GDNF في 10 نانوغرام / مل لتحفيز المعوي الهجرة NCC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الودائع حوالي 480 ميكرولتر في كل بئر من صف واحد في 24 لوحة جيدا. تجنب الفقاعات. الصفوف المتبقية يمكن استخدامها لاختبار تأثير عوامل النمو الأخرى على الهجرة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالكولاجين بلمرة لا يقل عن 1 ساعة في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. تشريح الحيوانات 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التزاوج والتحقق من وجود المقابس المهبلية في صباح اليوم التالي. e0.5 اليوم يجري ظهر اليوم تم العثور على المكونات المهبل، وعزل الإناث والانتظار 12 يوما حتى E12.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران الحوامل مع isoflurane والموت ببطء وعن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الفأر مع الايثانول 70٪. رفع و البطنالقربى وفتح تجويف البطن مع مقص تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرحم في طبق بتري زجاجية مملوءة الجليد الباردة PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). قطع الرحم بشكل مستعرض بين تورمات deciduum الفردية لعزل كل موقع غرس الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل على كل موقع على حدة زرع في طبق بتري الزجاج أخرى مليئة PBS الجليد الباردة. تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط غرامة لإزالة طبقة عضلة الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الكيس المحي الحشوية والسلى للكشف عن الجنين. أخذ الحذر عند قطع الأوعية الدموية الانضمام إلى الجنين إلى المشيمة / الحشوية الكيس المحي، كما أنها تتشابك مع الأمعاء النامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجنين في الرقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ملقط مغلقة في تجويف البطن للجنين، فوق الكبد حمراء بلون الظلام، والسماح للملقط مفتوحة من نفسها (وقف الضغط) لجعل افتتاح مستعرضة في تجويف البطن. سحب الملقط فتحت أسفل نحونهاية الخلفي من الجنين لفتح البطن تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على الأنسجة الضامة وراء الكبد وسحب الشجاعة للخروج من البطن، والحرص على عدم كسر الأمعاء (مرفق القولون إلى الشرج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القولون لتحرير الشجاعة من بقية الجنين. ويمكن إجراء خفض في أي مكان على طول القولون. نحتفظ جزء الذيل في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف من النسيج الضام من الأعور، ثم بقية الأمعاء. يجب الحرص على عدم جرح الأمعاء أثناء القيام بذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعيدا الكبد والمعدة (على نهاية منقاري من الأمعاء الدقيقة)، وكذلك mesonephros والتلال الأعضاء التناسلية إذا كان بعض موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأمعاء الدقيقة. مرة أخرى، يجب الحرص على عدم وأد الأمعاء. من الآن فصاعدا، يمكن تتبع التوجه rosrrocaudal من أنسجة الأمعاء باستخدام انحناء حاد موجودة على نهاية منقاري. ترك الأمعاء الدقيقة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة قدر الإمكان قبل مالفراش (انظر الخطوة 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، تسجيل عدد من somites الذيل لكل الجنين لتحديد بدقة مرحلة التطور الجنيني. </li></ol> 3. باجتزاء الجنينية الأمعاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الشروع في تشريح الجنين، تذوب 1.5 غرام الاغاروز في 100 مل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) والحفاظ على 50 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب ذاب الاغاروز إلى العفن التضمين (على سبيل المثال مغلقة 2 مل أنبوب microcentrifuge التي تم قطع بالطول لاستئصال حوالي 1/4 من جدار الأنبوب). السماح للالاغاروز يبرد إلى حوالي 42-45 درجة مئوية، وينبغي أن يكون فقط دافئ قليلا لمسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأمعاء الجنينية قبل يتصلب الاغاروز (وهذا يمكن أن يتم تقييمها مع ملقط النصائح وسوف تحدث حول 36-38 درجة مئوية). عقد الأمعاء مع ملقط بحلول نهاية منقاري مطوية، تسحبه ببطء شديد من خلال الاغاروز على طول القالب. وهذا يساعد على الحفاظ على الأمعاء على التوالي في حين أن مجموعات الاغاروز. الافراج عن رتصدر بمجرد أن تبدأ لمقاومة يجري نقلها. تتبع توجيه منقاري الذيلية للامعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القالب في الثلاجة مدة 2-3 دقائق، لضمان الاغاروز وقد وضعت تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج الاغاروز من العفن (من الانزلاق للخروج من أنبوب إيبندورف فتح). بشفرة، واخراج الاغاروز الزائدة عند كلا الطرفين، مما يجعل التخفيضات عمودي على الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء نهاية منقاري من الأمعاء / الاغاروز منع أسفل على المسرح معدنيه مشراح تهتز مع النصل. تقليم الاغاروز الزائدة على جانبي كتلة الأمعاء / الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل المرحلة المعدنية على غرفة مشراح تهتز. إذا لزم الأمر، وضبط زاوية من مرحلة حتى الأمعاء رأسيا قدر الإمكان (وبالتالي عمودي على النصل). تغطية العينة مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. جلب شفرة مشراح وصولا الى بضعة ملليمترات تحت سطح العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 200 ميكرون vibratome عرضية تخفيضات من الأمعاء-الذيلية معظم الصغيرة، وضمان أن هيحتوي منظمة العمل ضد الجوع شريحة الاغاروز قسم المعوية الكاملة. </li></ol> 4. ثقافة المعوية إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع بلطف قطع طازجة شرائح الأمعاء / الاغاروز شقة على المواد الهلامية الكولاجين مع ملقط، ووضع شريحة واحدة نحو منتصف كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 3 أيام عند 37 درجة مئوية، في الرطبة 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، للسماح للهجرة NCC من ازدراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ شرائح الأمعاء / الاغاروز قبالة هلام الكولاجين بلطف شديد مع ملقط. والحرص على عدم تلف هلام أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب لمس هلام الكولاجين مباشرة خلال الخطوات الحضانة وغسل اللاحقة من أجل ضمان أن نمط الهجرة الخلية لا تضطرب. إصلاح مع 500 ميكرولتر من PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) (في برنامج تلفزيوني) لكل بئر 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال تثبيتي مع 500 ميكرولتر من دابي (4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole) حل (5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لكل بئر واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل 3X جيدامع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير الخلايا الفلورسنت (GFP القنوات ودابي) جزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين داخل كل بئر. </li></ol> 5. تحليل صورة قدمنا ​​الاستخدام الواسع النطاق لليماغيج 17 إلى معالجة وتحديد الصور ولدت بعد الثقافة ازدراع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ من خلال التصوير شريحة ميكرون في نفس التكبير كما الصور الخلية الفلورسنت. قياس طول واحد ميكرون بالبكسل (باستخدام أداة خط مستقيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مقياس (تحليل / مجموعة مقياس، وعدد من المدخلات بكسل / ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صورة GFP مضان، وتغيير شكل صورة إلى 8 بت والرمادي (Image/Type/8-bit). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط شدة الإشارة (صورة / ضبط / السطوع / التباين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح ضجيج في الخلفية إذا لزم الأمر (عملية / طرح الخلفية؛ ضبط نصف قطرها المتداول الكرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عتبة لتسليط الضوء على الخلايا وكتل الخلية (الصورة / ضبط / عتبة)، ون تطبيق مستجمعات المياه لتقسيم كتل (عملية / ثنائي / مستجمعات المياه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الجزيئات لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) وتوليد إحصاءات عدد الخلايا (تحليل / تحليل الجسيمات، وحجم مجموعة الحد الأدنى لاستبعاد المتبقية بكسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين خيارات القياس لتشمل القطر فيريه في (تحليل / مجموعة القياسات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة رويس وقياس ككل لتحديد قطرها فيريه، ومؤشرا على انتشار الخلية (تحليل / أدوات / مدير ROI / عن / OR، ثم مدير ROI / إضافة، ومدير ROI / قياس). </li></ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وتبين لنا كيف يمكن استخدام لدينا فيفو السابقين الثقافة ازدراع تقنية لقياس بدقة المعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود GDNF. ومثل هذا القياس الكمي الدقيق سهلت إلى حد كبير باستخدام 200 ميكرون سميكة المقاطع vibratome الأمعاء بدلا من قطع كبيرة من حجم تقريبي، كما هو موضح سابقا 11،12،15. في الواقع، وهذا يسمح لنا بالعمل مع عدد معقول من الخلايا في إعداد تكرار للغاية. من المذكرة، وتوزيع موحد من الفلورسنت المعوي NCC داخل المنطقة الذيلية الأكثر من الأمعاء الدقيقة التي يتم قط...

الخلايا العصبية قمة (NCC) هي نوع من الخلايا عابرة فريدة لالفقاريات التي تشكل العديد من المشتقات أثناء تطور الجنين. تنشأ هذه الفئة من السكان الخلية على الحدود من لوحة العصبية، المتاخمة للالأديم الظاهر غير العصبية 1. أثناء تكون العصيبة، الانحناء من الأماكن لوحة العصبية NCC على طول الحافة الظهرية من تشكيل الأنبوب العصبي. NCC ثم الخضوع لالظهارية الانتقالية الوسيطة، وفصل المهاجرة بعيدا عن الأنبوب العصبي. NCC استعمار مختلف الهياكل الجنينية، بما في ذلك الجهاز الهضمي حيث أنها تشكل الجهاز العصبي المعوي بأكمله (ENS)، وهي شبكة مترابطة من العقد العصبية جزءا لا يتجزأ في جدار الأمعاء. كما استعرضت مؤخرا 2،3، وقد شاركت العديد من الجينات في تطوير هذه البنية المعقدة. ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من NCC تنشأ من الأنبوب العصبي المبهم (أي حول الحدود المستقبلية الدماغ المؤخر / الحبل الشوكي) 4.هذه الأسلاف العصبية تصل إلى المعى الأمامي حول يوم الجنينية (ه) 9.0 في الفئران ثم تهاجر نحو caudally داخل اللحمة المتوسطة الأمعاء حتى e15.0 تقريبا لاستعمار الامعاء الجنينية كله. يتم توفير مجموعة فرعية صغيرة من الأسلاف العصبية القولون أيضا العجزية NCC، التي تغزو الأمعاء الخلفي في الاتجاه المعاكس حتى الأعور 4. كلا المبهم والعجزية NCC تتطلب متعددة الهجرة، الانتشار، والبقاء على قيد الحياة تعزيز التمايز العظة لضمان تشكيل كامل للENS. في هذا الصدد، النماذج الحيوانية - وخاصة الفئران المعدلة وراثيا - كان لها دور أساسي في تحديد عدة بروابط خارج الخلية الأساسية: GDNF (الدبقية المستمدة من الخلايا عامل التغذية العصبية)، Endothelin-3، Neurotrophin-3، أفضل الممارسات الإدارية (العظام البروتينات morphogenic)، Netrin ، وكذلك سونيك القنفذ الهندي و(شش وIHH) 5-10. من هذه، GDNF من خلال إشارات التيروزين كيناز عبر الغشاء مستقبلات RET (مؤجلة خلال ترنسفكأيشن) يتم التعرف على اله الطريق الأكثر أهمية لجذب وتوجيه NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. ويفرز GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء ويشكل التدرج rosrrocaudal تسيطر spatiotemporally هذا هو chemoattractive مباشرة إلى المعوية NCC والتي تعبر RET 11،12. بين وظائف أخرى، وENS ينظم الحركة داخل الجهاز الهضمي من خلال تفاعله مع العضلات الملساء في جدار الأمعاء. غياب العقد العصبية في المنطقة الطرفية من نتائج الأمعاء في مرض هيرشسبرونغ: انكماش منشط للجزء المتأثر يؤدي إلى انسداد، وتراكم المنبع من المواد هضمها وانتفاخ هائلة من الأمعاء والبطن. يحدث المرض هيرشسبرونغ ما يقرب من واحد في 5،000 ولادة حية. ويعتقد أن نمط الهجرة rostro الذيلية المعوي NCC أن يكون عاملا مساهما الرئيسي لمسببات المرض هيرشسبرونغ. القولون، أبعد من مصدر المهاجرة NCC والجزء الأخير من بowel أن المستعمر، هو الأكثر عرضة للعيوب في تشكيل ENS. وفقا لدورها الحاسم في المعوي الهجرة NCC، تعطل GDNF / RET الإشارات هو سبب وراثي معروف الرئيسي للمرض هيرشسبرونغ 13. لدراسة أفضل NCC والتنمية ENS، ولدت لدينا خط الماوس المعدلة وراثيا - اسمه Gata4p [5KB]-GFP 14 - التي وصفت المهاجرة NCC مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نحن الكمال المقبل بحكم فيفو مقايسة الهجرة الخلية، مقتبسة من الأعمال المنشورة من قبل مجموعات أخرى 11،12،15، التي تسمح الآن الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، مثل GDNF.

<table><tbody><tr><td>مسحوق DMEM</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td> نظام الترشيح الفراغي <td>Steriflip الصف للتكنولوجيا الحيوية</td></tr><tr><td>(0.22 ميكرون)</td> <td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>محلول البنيسيلين ستربتومايسين ، 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td> <td>& nbsp ؛</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>جودة</td></tr><tr><td>عالية الصف الكولاجين I</td><td>BD العلوم البيولوجية</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>مخفف من مخزون 10 N ثم معقم</td></tr> مرشح <tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>مقص تشريح</td><td>فيشر Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>طبق بتري زجاجي</td><td>VWR</td><td>89000-306</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>مجهر تشريح الصف لثقافة الخلية</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M125</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>Dumont # 5 أدوات</td><td>العلوم الدقيقة</td> ملقط <td>11251-20</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td> شفرة <td>جراحية من الدرجة التكنولوجيا</td></tr><tr><td>الحيوية</td><td>ريشة</td><td>21</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>جميع الأغراض الفورية كرازي الغراء القلم</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>HM 650V الاهتزازية شفرة Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>بارافورمالدهايد</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan = "4" > جدول الكواشف والمعدات المحددة.</td></tr></tbody></table>

مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

الخلايا العصبية قمة (NCC) هي خلية السكان عابرة ومتعددة القدرات التي تنبع من الأنبوب العصبي الظهري ويهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الفقاريات النامية الجنين. بالإضافة إلى توفير الدبقية والخلايا العصبية الطرفية، NCC توليد الخلايا الصباغية وكذلك معظم هيكل عظمي القحف الوجهي. يتم التحكم NCC الهجرة والتمايز من خلال مزيج من الأصل المحوري على طول الأنبوب العصبي وتعرضهم للالعظة خارج الخلية متميزة إقليميا. هذه المساهمة من خارج الخلية بروابط هو واضح خصوصا خلال تشكيل النظام العصبي المعوي (ENS)، وهي شبكة معقدة مترابطة من العقد العصبية التي تتحكم محليا (بين أمور أخرى) حركة العضلات والأمعاء على الحركة المعوية. ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من الأولي NCC أن القيام برحلة طويلة من أجل استعمار - في منقاري إلى الذيلية الأزياء - على طول القناة الهضمية المحتملين. من بين عدة مسارات الإشارات المعروفة لالتأثير المعوي NCC الاستعمار، ومن المسلم به GDNF / RET إشارات على أنها الأكثر أهمية. في الواقع، تسيطر إفراز spatiotemporally من RET يجند GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء هو المسؤول الرئيسي لجذب وتوجيه، معربا عن RET المعوي NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. هنا، نحن تصف فيفو السابقين فحص الهجرة الخلية، والاستفادة من خط الماوس المعدلة وراثيا امتلاك fluorescently المسمى NCC، والذي يسمح الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، بما في ذلك GDNF.

النتائج التالية تمثل ما يمكن الحصول مع تقنية الموضحة هنا (الشكل 1). استخدام عوامل النمو (أي GDNF) يحفز هجرة المعوي NCC من ازدراع المعوية وإلى هلام الكولاجين، معربا عن GFP (الشكل 2). على الرغم من بعض الخلايا تخرج من ازدراع في غياب عوامل النمو، وهذه هي في الغالب لا GFP المسمى وتمثل دخول السلبي. فمن الضروري إزالة شريحة المعوية من هلام الكولاجين من أجل تسجيل النتائج، حيث أن هذا النسيج لا تزال مكتظة بالسكان الخلايا الفلورسنت ولن تخفي وإلا فإن ...

نقدم بحكم فيفو خلية مقايسة الهجرة التي تسمح الكمي الدقيق للالمعوي العصبية المحتملة الهجرة الخلية قمة في وجود عوامل النمو المختلفة.

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس قدرة هجرة السلائف العصبية المعوية في وجود عوامل نمو مختلفة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الأمعاء الدقيقة لأجنة الفئران المأهولة بخلايا القشرة العصبية الفلورية. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام الميكروتوم الاهتزازي لعمل شرائح من الأمعاء بسمك 200 micron.بعد ذلك، تُحضن هذه الشرائح فوق هلام كولاجين يحتوي على عوامل نمو. وتتمثل الخطوة النهائية في تقشير الشرائح للكشف عن الخلايا المهاجرة الموجودة أسفلها. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لإظهار نمط الخلايا المهاجرة داخل هلام الكولاجين.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في علم الأحياء النمائي، مثل توفير فهم أفضل للتفاعل بين مسارات الإشارات المختلفة التي تكمن وراء تكوين الجهاز العصبي المحيطي. بعد 12 يومًا من العثور على السدادة المهبلية، يتم قتل أنثى الفأر رحيمًا واستئصال الرحم، ثم وضع الرحم في طبق بتري زجاجي مملوء بالثلج. وباستخدام PBS بارد، يتم قطع الرحم عرضيًا بين انتفاخات القرنين الفردية لعزل كل موقع انغراس للجنين تحت مجهر تشريحي، ثم تُستخدم ملقط دقيقة لإزالة الطبقة العضلية للرحم.افتح كيس المح يلحمي والغشاء السلوى للكشف عن الجنين. توخَّ الحذر عند قطع الأوعية الدموية التي تربط الجنين بكيس المح، حيث تكون متشابكة مع الأمعاء النامية. بعد ذلك، أدخل ملقطاً مغلقاً في التجويف البطني فوق الكبد ذو اللون الأحمر الداكن مباشرةً ثم افتحه.يؤدي ذلك إلى إحداث فتحة مستعرضة في تجويف البطن. اسحب الملقط المفتوح للأسفل باتجاه الطرف الخلفي للجنين لفتح البطن بالكامل. وبمجرد الفتح، أمسك بالنسيج الضام خلف الكبد واسحب الأحشاء للخارج.مع توخي الحذر لتجنب تمزيق الأمعاء، يتم قطع القولون من أي موضع لتحرير الأحشاء من بقية الجنين. احتفظ بجزء الذيل لاستخدامه لاحقاً.قم بفصل النسيج الضام عن الأعور ثم الأمعاء مع الحرص الشديد على عدم جرحها عند الطرف المنقاري للأمعاء الدقيقة. استأصل الكبد والمعدة بالإضافة إلى المساريقا، والكلى، والنتوءات التناسلية في حال وجودها. وأخيراً، اعزل الأمعاء الدقيقة عن طريق قطع الأعور والقولون بالإضافة إلى ما تبقى من النسيج الضام.كما سبق، احرص على عدم جرح الأمعاء. اترك الأمعاء الدقيقة في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة لأقصر فترة زمنية ممكنة قبل عملية التضمين. بعد فصل الجنين عند الرقبة، سجل عدد القطع العضلية (somites) في الذيل لتحديد مرحلة التطور الجنيني بدقة.قبل البدء في تشريح الأجنة، قم بإذابة 1.5 grams من agros في 100 milliliters من PBS واحفظها عند 50 °C. قم بتجهيز قالب التضمين عن طريق قطع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة two milliliter طولياً لاستئصال حوالي ربع جدار الأنبوب. صب agros المذاب في القالب واتركه يبرد حتى يصبح دافئاً قليلاً عند لمسه.عندما تكون جاهزاً، أمسك الأمعاء باستخدام الملقط من الطرف المنقاري المطوي، واسحبها ببطء شديد عبر الأجار، على طول قالب الصب. يساعد ذلك في الحفاظ على استقامة المعي بينما يتصلب الأجار؛ حرر النسيج بمجرد أن يبدأ في مقاومة التحريك، وتتبع اتجاه الطرف المنقاري للمعي. بعد ذلك، ضع القالب في الثلاجة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ليتصلب تماماً.بمجرد أن يتصلب، أخرج عينات الـ agros من القالب وقم بتشذيب الزوائد من كلا الطرفين، بحيث تكون القطوع عمودية على الأمعاء. قم بلصق الطرف المنقاري لكتلة الـ agros على المنصة المعدنية للميكروتوم وقم بتشذيب الزوائد من جميع الجوانب. بعد ذلك، قم بتركيب المنصة المعدنية في غرفة الميكروتوم الهزاز.إذا لزم الأمر، اضبط زاوية المنصة بحيث تكون الأمعاء عمودية قدر الإمكان. غطِّ العينة بمحلول PBS بارد جداً قبل خفض شفرة الميكروتوم إلى بضعة مليمترات تحت سطح المحلول المنظم. وعند الجاهزية، قم بإجراء قطوع مستعرضة بسماكة 200 micron من الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة.التأكد من أن كل شريحة زراعية تحتوي على مقطع معوي كامل. ضع الشرائح المقطوعة حديثاً برفق فوق هلام كولاجين تم تحضيره مسبقاً. ضع شريحة واحدة باتجاه منتصف كل بئر للسماح بهجرة خلايا العرف العصبي خارج الأنسجة، ثم قم بحضن الشرائح لمدة ثلاثة أيام.بعد انقضاء هذا الوقت، انقل الشرائح بعيداً عن هلام الكولاجين بلطف باستخدام الملقط مع الحرص على عدم إتلاف الهلام الموجود بالأسفل. ولضمان عدم تعطل نمط هجرة الخلايا، من المهم تجنب لمس هلام الكولاجين مباشرة خلال خطوات الحضانة والغسيل اللاحقة. أولاً، قم بتثبيت الخلايا باستخدام 500 µL من 4%PFA لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، استبدل المثبت بـ 500 microliters من محلول DPI لكل بئر واتركها للحضن لمدة 10 دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة محلول DPI بعناية واغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 500 microliters من PBS لمدة خمس دقائق. وأخيراً، قم بتصوير الخلايا الفلورية المدمجة في هلام الكولاجين داخل كل بئر.في هذا المثال، استُخدمت عوامل النمو لتحفيز هجرة الخلايا العصبية المعوية التي تعبر عن GFP. يمثل الخط المنقط الحجم والموقع التقريبي للقطعة النسيجية المستأصلة. وقبل إزالتها من الهلام، وُجد أن عدد وانتشار الخلايا التي تعبر عن GFP والمهاجرة خارج القطعة النسيجية المعوية كانت أكبر بكثير في الظروف المعالجة مقارنة بالظروف غير المعالجة.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحديد إمكانية هجرة السلائف العصبية المعوية عن طريق تحضين شرائح معوية فوق هلام كولاجين يحتوي على عوامل نمو.

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شحيحة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية ، وبدوره حولها الساعة الحرجة.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

يصف هذا البروتوكول مقايسة شريحة عضوي النمط الأمثل للدماغ بعد الولادة وعالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير الهجرة neuroblast في تيار الهجرة منقاري.

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.

A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

يوضح هذا الفيديو مقايسة هجرة الغلاف العصبي للخلايا السليفة العصبية - وهو اختبار في المختبر لدراسة الاستجابة المهاجرة للخلايا السليفة العصبية من الغلاف العصبي - عن طريق التحليل المجهري.

فحص الغلاف العصبي NPC: اختبار في المختبر لتقييم الاستجابة المهاجرة للخلايا السليفة العصبية من الغلاف العصبي

نحن هنا وصف خلية شوان (SC) مقايسة الهجرة التي الطوائف المنبوذة هي قادرة على تطوير محاور عصبية على طول تمديد.

تحليل الفئران خلايا شوان التنمية جنبا إلى جنب المحوار النامي

الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوارض بعد الولادة منقاري تيار المهاجرة.

Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em&gt; في المختبر</em

زرع الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) يحمل وعودا كبيرة في الأعصاب التجدد. تحولت تسليم النظامية من الشخصيات في انخفاض الغازية، وعلاجية فعالة جدا بروتوكول فعالة، لتقديم الخلايا الجذعية في الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي.

حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن

الظهارية إلى الانتقال اللحمة المتوسطة (EMT) تسمح للسرطانات بأن تصبح غازية. للتحقيق في EMT ، يتم وصف نموذج مختبري قائم على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) خال من المصل والإنزيمات. يسمح هذا النظام الموحد بالتقييم الكمي والنوعي لهجرة الخلايا والتعبير الجيني والبروتيني. النموذج مناسب لاكتشاف الأدوية.

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

العمليات النمائية مثل الانتشار، والهجرة، وثمرة نورت هي غالباً بالقلق في الأمراض العصبية. وبالتالي، فإننا نقدم بروتوكولات لتقييم سرعة وتكاثر هذه العمليات النمائية في الشخصيات البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية. كما تسمح هذه البروتوكولات تقييم آثار عوامل النمو ذات الصلة والمداواة في التنمية للمجلس الوطني.

الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)

نقدم ثلاثة بسيط في المختبر ومقالات الهجرة لمسافات طويلة ، والدراسة المشتركة للهجرة الثقافة ، والكيميائية جاذبية الجاذبية والمواد التي تقيم بشكل جماعي وظائف الخلايا الجذعية البشرية المستمدة الخلايا البطانية التشعبية ولهم التفاعل مع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic.

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

اكتشف مقايسة الهجرة الخلية الكمي لأسلاف العصبية المعوية في أجنة الفئران باستخدام شرائح الأمعاء الدقيقة والمجهر الضوئي. تساعد هذه الطريقة في فهم تكوين الجهاز العصبي المحيطي.

مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

استكشف المزيد من الفيديوهات