مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد إمكانات الهجرة للأسلاف العصبية المعوية في وجود عوامل نمو مختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الأمعاء الدقيقة الجنينية للفأر التي تسكنها خلايا القشرة العصبية الفلورية. الخطوة الثانية هي استخدام ميكروتوم اهتزازي لعمل شرائح من الأمعاء بسمك 200 ميكرون.

بعد ذلك ، يتم تحضين هذه الشرائح فوق هلام الكولاجين الذي يحتوي على عوامل النمو. الخطوة الأخيرة هي تقشير الشرائح للكشف عن الخلايا المهاجرة تحتها. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري لإظهار نمط الخلايا المهاجرة داخل هلام الكولاجين.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في علم الأحياء التنموي ، مثل توفير فهم أفضل للتفاعل بين مسارات الإشارات المختلفة الكامنة وراء تكوين الجهاز العصبي المحيطي. بعد 12 يوما من العثور على سدادة مهبلية ، قتل أنثى الفأر وإزالة الرحم ، ووضع الرحم في طبق بتري زجاجي مليء بالثلج. يقطع PBS البارد الرحم بشكل عرضي بين التورمات الفردية لعزل كل موقع زرع جنين تحت مجهر تشريح ، واستخدام ملقط دقيق لإزالة الطبقة العضلية للرحم.

افتح كيس صفار البيض الحشوي والسلى للكشف عن الجنين. توخ الحذر عند قطع الأوعية الدموية ، وربط الجنين بكيس الصفار لأنها متشابكة مع الأمعاء النامية. بعد ذلك ، أدخل ملقطا مغلقا في تجويف البطن فوق الكبد الأحمر الداكن واتركه يفتح.

هذا يخلق فتحة عرضية في تجويف البطن. اسحب الملقط المفتوح لأسفل باتجاه الطرف الخلفي للجنين لفتح البطن تماما. بمجرد فتحه ، أمسك النسيج الضام خلف الكبد واسحب الشجاعة للخارج.

الحرص على عدم كسر الأمعاء. قطع القولون في أي مكان لتحرير الأحشاء من بقية الجنين. احتفظ بجزء الذيل لوقت لاحق.

قم بإخراج النسيج الضام من الأعور ثم تعمل الأمعاء بحذر حتى لا تجرحها في الطرف المنقاري للأمعاء الدقيقة. قطع الكبد والمعدة وكذلك الميزو والكلية وحواف الأعضاء التناسلية إن وجدت. أخيرا ، اعزل الأمعاء الدقيقة عن طريق قطع الأعور والقولون وكذلك النسيج الضام المتبقي.

كما كان من قبل ، احرص على عدم تقطيع الأمعاء. اترك الأمعاء الدقيقة في PBS في درجة حرارة الغرفة لأقصر وقت ممكن قبل التضمين. بعد قطع الجنين في الرقبة ، سجل عدد جسيدات الذيل لتحديد مرحلة التطور الجنيني بدقة.

قبل الشروع في تشريح الأجنة ، قم بإذابة 1.5 جرام من agros في 100 مل من PBS واحتفظ بها عند 50 درجة مئوية. قم بإعداد قالب التضمين عن طريق قطع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر بالطول لاستئصال حوالي ربع جدار الأنبوب. صب agros المذاب في القالب واتركه يبرد حتى يصبح دافئا قليلا عند لمسه.

عندما تصبح جاهزا ، أمسك الأمعاء بالملقط من الطرف المنقاري المطوي واسحبه ببطء شديد عبر agros ، على طول القالب. يساعد هذا في الحفاظ على استقامة القناة الهضمية بينما تطلق المجموعات الزراعية الأنسجة بمجرد أن تبدأ في مقاومة التحرك وتتبع اتجاه القناة الهضمية المنقارية. بعد ذلك ، ضع القالب في الثلاجة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتماسك تماما.

بمجرد ضبطه ، قم بإزالة agros من القالب وقم بقص agros الزائد من كلا الطرفين ، مما يجعل الجروح عموديا على الأمعاء. قم بلصق الطرف المنقاري لكتلة agros على المرحلة المعدنية من microtome وقم بقص الفائض من جميع الجوانب. بعد ذلك ، قم بتركيب المرحلة المعدنية على غرفة الميكروتوم الاهتزازية.

إذا لزم الأمر ، اضبط زاوية المسرح بحيث تكون الأمعاء عمودية قدر الإمكان. قم بتغطية العينة ب PBS المثلج البارد قبل خفض شفرة الميكروتون إلى بضعة ملليمترات تحت السطح العازل. عندما تصبح جاهزا ، قم بعمل قطع عرضية بحجم 200 ميكرون من معظم الأمعاء الدقيقة.

التأكد من أن كل شريحة زراعية تحتوي على قسم معوي كامل. ضعي الشرائح المقطعة حديثا برفق على جل الكولاجين المعد مسبقا. ضع شريحة واحدة في منتصف كل بئر للسماح بهجرة خلايا القمة العصبية خارج الباذنجان ، واحتضان الشرائح لمدة ثلاثة أيام.

بعد هذا الوقت ، انزع الشرائح من جل الكولاجين برفق باستخدام ملقط مع الحرص على عدم إتلاف الجل أدناه. لضمان عدم إزعاج نمط هجرة الخلايا ، من المهم تجنب لمس هلام الكولاجين مباشرة أثناء خطوات الحضانة والغسيل اللاحقة. أولا ، قم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، استبدل المثبت ب 500 ميكرولتر من محلول DPI لكل بئر واحتضانه لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول DPI بعناية وغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتصوير الخلايا الفلورية المضمنة في هلام الكولاجين داخل كل بئر.

في هذا المثال ، تم استخدام عوامل النمو لتحفيز هجرة GFP التي تعبر عن خلايا القشرة العصبية المعوية. يمثل الخط المنقط الحجم التقريبي وموقع العرض. قبل إزالته من الجل ، وجد أن عدد وانتشار الخلايا التي تعبر عن GFP التي تهاجر خارج الخطة المعوية كان أكبر بكثير في الحالات المعالجة مقابل الحالات غير المعالجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد إمكانات هجرة الأسلاف العصبية المعوية عن طريق احتضان شرائح الأمعاء فوق هلام الكولاجين الذي يحتوي على عوامل النمو.