الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الطفرات الجسدية في الجينات المرتبطة بالسرطان للخلايا من أنسجة الورم باستخدام مكتبات الحمض النووي متعددة الإرسال المشفرة ، متبوعة بتسلسل متوازي على نطاق واسع. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط محولات التسلسل الشريطي أولا بشظايا الحمض النووي المعزولة من الأورام المحفوظة. الخطوة الثانية من الإجراء هي التهجين إلى قليل النوكليوتيدات الحيوية المخصصة ، المكملة لجميع إكسونات طلاء البروتين ل 279 جينا مسرطن وجينات مثبطة للورم.

تتمثل الخطوة الثالثة في إجراء تسلسل متوازي على نطاق واسع لتجمعات الترميز الشريطي من المكتبات التي تم التقاطها. الخطوة الأخيرة هي البحث في بيانات التسلسل للتغيرات المرتبطة بالسرطان للجينات المستهدفة البالغ عددها 279. يمكن أن يكشف هذا الإجراء عن طفرات التسلسل ، والإدخالات الصغيرة ، والحذف الصغير ، وتغييرات رقم النسخ ، وتحديد التعديلات الهيكلية.

لذا فإن المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تسمح للمرء بالتحقيق في الإكسونات بأكملها لكل من الطفرات الشائعة والنادرة ، بالإضافة إلى تحديد التغيرات الجينومية الإضافية مثل خسائر عدد النسخ والمكاسب ، وتحقيق حساسية أكبر في العينات غير المتجانسة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال جينوم السرطان ، مثل ما هي الطفرات الدافعة الرئيسية في أنواع السرطان المختلفة ، وهل ترتبط هذه الطفرات في العينات السريرية بالنتائج أو الاستجابة للعلاجات المستهدفة؟ تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص السرطان وعلاجه لأنه يمكن تحديد الطفرات بشكل مستقبلي واستخدامها للمساعدة في توجيه المرضى إلى العلاجات والتجارب السريرية المناسبة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوة تنظيف النحل بسبب تقنية الحذر اللازمة أثناء غسل الحمض النووي ومراوغته من الخرز قم بإعداد مزيج الإصلاح النهائي الرئيسي. امزج الأحجام المناسبة للحصول على 50 ميكرولتر لكل عينة. قم بتقسيم 50 ميكرولترا من كل حمض نووي شفاف في آبار منفصلة من صفيحة ID ستة آبار.

ثم أضف 50 ميكرولترا من مزيج الإصلاح النهائي الرئيسي المحضر إلى كل تفاعل واحتضان اللوحة في جهاز تدوير حراري لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية لتنظيف التفاعل. أولا، أضف 200 ميكرولتر من حبيبات XP النقية AMP إلى كل عينة وقم برفع مستوى الصوت بالكامل برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات. اتبع ذلك عن طريق احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، انقل الألواح إلى الحامل المغناطيسي واتركها تمسح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إزالتها ، قم بإزالة وتخلص من معظم المادة الطافية برفق مع الحرص على عدم إزعاج الخرز. قد تبقى بعض السوائل في الآبار.

ثم أضف برفق 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى كل عينة واحتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة الماصة بعناية وكرر الغسيل مرة أخرى. بعد ذلك ، اترك الطبق يجف في درجة حرارة الغرفة حتى يهرب كل الكحول.

الآن أعد تعليق الخرزات المجففة في 44.5 ميكرولتر من الماء المعقم. قم بتدفق كل عينة برفق عبر الماصة 10 مرات مع آخر طرد. اشطف أي حبات متصلة بجانب البئر.

الآن احتضان حبات الماء المعلقة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم انقلها إلى الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق حتى تصبح الآبار صافية. أخيرا ، انقل برفق 42 ميكرولترا من المادة الطافية الصافية في كل بئر ، والتي تحتوي على العينة إلى بئر جديد. يمكن الآن تخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع.

ابدأ بإعداد مزيج المخلفات الرئيسي D في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. أضف ثمانية ميكرولترات من مزيج مخلفات DA الرئيسي المحضر إلى كل بئر من الحمض النووي الذي تم إصلاحه في النهاية. ثم احتضان اللوحة في جهاز تدوير حراري لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتنظيف التفاعل.

استخدم نفس العملية الموضحة في القسم السابق بضعف الحجم وانتهي من خلال تعليق الخرزات في 33.75 ميكرولتر من الماء المعقم. في هذه المرحلة ، يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع. للاستمرار ، قم بإعداد مزيج رئيسي للربط لمدة 15 ميكرولتر لكل تفاعل.

أضف 15 ميكرولترا من مزيج الربط الرئيسي إلى كل بئر يحتوي على الحمض النووي للذيل D. بعد ذلك ، أضف 1.25 ميكرولتر من 25 ميكرومولار المناسبة. التالي محول الباركود المرن.

لكل منها ، حسنا ، يجب أن تتلقى كل عينة محول باركود منفصل. بمجرد تحميل المحولات ، احتضن اللوحة لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. الآن باستخدام 50 ميكرولترا من الخرز ، قم بإجراء تنظيف ربط محول ما بعد وإعادة تعليق العينة في ماء معقم إلى 50 ميكرولترا.

ثم قم بعملية التنظيف مرة ثانية مع الانتهاء من 23 ميكرولتر من الماء. في هذه المرحلة ، يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع. تتمثل الخطوة التالية في تضخيم كل عينة في المكتبة ، والتي تم تفصيلها في بروتوكول النص حول ذوبان الجليد ، وحاصرات قليل النوكليوتيدات العالمية والفهرس ، ومكتبة CCAP السهلة ، ومكونات التقاط الجيل الذكي ، والتي تشمل مخزن مؤقت تهجين TNA two X ، ومكون التهجين.

أ- الآن قم بإعداد مجموعة واحدة من حاصرات قليل النوكليوتيدات الفهرس المقابلة لتسلسلات المحول الشريطي المحددة المستخدمة في إعداد المكتبة. اجمع بين ميكرولتر واحد من كل مانع وقم بدوامها معا لمدة 10 ثوان في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، قم بإعداد مزيج الالتقاط الذي يتكون من خمسة ميكرولتر من conte A بمعدل ملليغرام واحد لكل مليلتر ، وميكرولترين من الحاجز العالمي وميكرولترين من تجمع الحاصرات. قم بتجميع 24 مكتبة مشفرة في تفاعل واحد.

أضف ما مجموعه من واحد إلى ثلاثة ميكروغرام من مكتبة تسلسل الرموز الشريطية المجمعة إلى مزيج الالتقاط. قم بعمل 15 إلى 20 ثقبا في الغطاء باستخدام مقياس 20 أو سرعة إبرة أصغر ، وقم بتفريغ الخليط في مكثف فراغ الحمض النووي عند 60 درجة مئوية حتى يجف تماما. بعد ذلك ، أعد ترطيب المزيج في مخزن التهجين ومكون التهجين أ.قم بتغطية الثقوب الموجودة في الغطاء بشريط لاصق ودوامة العينة لمدة 10 ثوان.

ثم الطرد المركزي المزيج بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان. الآن ، احتضان المزيج لفترة وجيزة عند 95 درجة مئوية لتغيير طبيعة الحمض النووي. اتبع ذلك ب 10 ثوان من الطرد المركزي بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة في أنبوب شريطي PCR سعة 0.2 ملليلتر يمزج 2.25 ميكرولتر من مجسات التقاط مكتبة ccap سهلة بنفس الحجم من الماء المعقم الخالي من النوكلياز.

ثم عند تفاعل أجهزة الطرد المركزي ، امزج الأنبوب وقم بتدفق الحجم الكلي برفق عبر طرف الماصة 10 مرات. الآن احتضان أنبوب 0.2 مليلتر في جهاز تدوير حراري عند 47 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة. حافظ على درجة حرارة غطاء الدراجة الحرارية عند 57 درجة مئوية لمنع التبخر وتثبيت درجة حرارة التفاعل بعد أيام.

استخدم خطوات غسل واستعادة الحمض النووي الملتقط. ثم استخدم بروتوكول Roche nimble gen المعدل لتضخيم تشطيب الحمض النووي الملتقط عن طريق تحديد كمية الحمض النووي الذي تم التقاطه باستخدام مقايسة الحساسية العالية للكيوبت. تم التقاط مجموعة واحدة من 24 مكتبة تسلسل مشفرة تحتوي على 12 زوجا طبيعيا للورم باستخدام مجسات من 279 جينا سرطانيا وتسلسلها على أنها اثنين في 75.

تجميع قراءات الزوج الأساسي على حارة واحدة من ورم خلية التدفق HighSeq 2000 والمكتبات العادية بنسبة اثنين إلى واحد. تظهر صورة IGV خصوصية تغطية التسلسل في exons of EGFR في سرطان الرئة ، وتمثل الأشرطة الرمادية قراءات تسلسل فريدة. كانت طفرة T two G غير متجانسة الزيجوت على اليمين موجودة في 24٪ من القراءات ، مما يشير إلى أنها بديل جسدي للأحماض الأمينية L 8 58 R.

لم تظهر أي من قراءات أنسجة الرئة الطبيعية طفرة TTA G هذه ، وبعض indels في ورم سرطان القولون والمستقيم ، أظهر الزوج الطبيعي إدخالا جسديا في جهاز كمبيوتر أو حذف إزاحة الإطار الجسدي لسبعة أزواج قاعدية. في TP 53 ، شوهدت أيضا تغييرات في عدد النسخ بين أزواج الورم الطبيعية. تمثل كل نقطة بيانات إكسون واحدا من 279 جينا مستهدفا.

يتم استنتاج مكاسب وخسائر رقم النسخ من الزيادات والنقصان في تسلسل الورم التغطية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ست ساعات ونصف لمشاركة إعداد المكتبة و 48 إلى 96 ساعة لتهجين الالتقاط إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. في حين أن إجراء هذا الاختبار مهم للغاية لتوخي الحذر من الملوثات أثناء إعداد المكتبة ، لأنه قد يربك تحليل البيانات باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل Sanger وتحليل الأجزاء من أجل الإجابة على أسئلة مثل ، كيف يمكنني التحقق من صحة التغيير المشكوك فيه؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مكتبات الحمض النووي المشفرة وإجراء التقاط Exxon على هذه المكتبات المجمعة.