طريقة سريعة وفعالة لتقييم الإمراض في أوستيلاغو مايديس على خطوط الذرة والتيوسينت
January 3rd, 2014
يوصف استخدام طريقة حقن الإبر لتطعيم الذرة ونباتات التيوسينت مع مسببات الأمراض النيروبية الحيوية أوستيلاغو مايديس. تسهل طريقة تلقيح حقن الإبر التسليم المراقب لمسببات الأمراض الفطرية بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل الأبريسوريا. هذه الطريقة هي فعالة للغاية، وتمكين التلقيح القابلة للاستنساخ مع U. maydis.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التلقيح من خلال حقن الإبرة ، وثقافة تعليق خلايا USTA Lago maus ، وإجراء فحص تفاعل مقاومة للمرض لخطوط متاهة tete و teosinte المتاهة. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار خطوط النبات أولا للتلقيح والفحص. بعد ذلك ، تزرع بذور تجارب التلقيح التجريبية وتجارب التلقيح بالإبرة.
بعد 10 أيام ، يتم حقن معلق الخلية المصنوع من U في جذع كل نبات. أخيرا ، تتم مقارنة تفاعلات المقاومة لمحطات التجارب والتحكم في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تلقيحا ناجحا بحقن الإبرة من خلال تصور النمط الظاهري للنبات الذي تم تلقيحه معك. مايس.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توصل العامل الممرض مباشرة بين الأوراق. هذا يلغي مشكلة تغلغل مسببات الأمراض. للبدء في اختيار خطوط النبات للتلقيح والغربلة كما هو موضح هنا ، تم استخدام خطين متاهة وخمسة خطوط تيوسينت و 40 متاهة من خطوط التقاطع Teosinte مع مقاومة غير مميزة ل U Mais لهذه الدراسة لتجارب التلقيح التجريبية والتحكم في حقن الإبرة.
ازرع أربع بذور من كل خط نبات في مسطحات صغيرة عن طريق دفع البذور حوالي نصف بوصة في التربة بإصبع وتغطيتها برفق بالتربة. ثم ضع النباتات في غرفة نمو وسقي البذور حتى تنقع ، مع التأكد من بقائها تحت التربة بعد الري. قم بزراعة النباتات في بيئات ليلا ونهارا تبلغ 28 و 20 درجة مئوية ، و 14 و 10 ساعات من دورات الضوء والظلام على التوالي.
وحوالي 500 ميكرومولار لكل متر مربع في الثانية من الإشعاع النشط ضوئيا في الجزء العلوي من المظلة. حافظ على الرطوبة النسبية أثناء النهار والليل عند حوالي 70٪ و 90٪ على التوالي ، واحتفظ بجميع النباتات في نفس غرفة النمو للحفاظ على بيئة نمو متطابقة عبر التجربة. بعد ثمانية أيام من زراعة البذور ، استخدم حلقة معقمة لرسم الهوية من مخزون الجلسرين المجمد على أجار سكر العنب للبطاطس أو احتضان ألواح المساعد الشخصي الرقمي عند 30 درجة مئوية لمدة يومين ومراقبتها بانتظام للتأكد من أنها تنمو جيدا تحت غطاء التدفق الرقائقي.
استخدم عود أسنان معقم لتحديد مستعمرة واحدة لكل سلالة ووضعها في ثلاثة أنابيب ملليلتر من مرق PD. احتضان المزارع عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة يومين ، وتحقق بشكل دوري من النمو. بعد ذلك ، قم بقياس OD 600 من الثقافات للتأكد من أنها نمت إلى OD 1.0.
باستخدام الماء ، قم بإحضار الثقافات إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مليون خلية لكل مليلتر في حجم نهائي يبلغ 30 ملليلترا. يؤدي هذا التركيز من تعليق الخلايا المسببة للأمراض باستمرار إلى إصابة جيدة بالنباتات. ثم قبل التلقيح ، امزج كميات متساوية من الاثنين اللذين صنعتهما كسلالات.
قبل ملء حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بتعليق الخلية ، املأ حقنة التحكم بالماء لحقنها بأقل قدر من الضرر للنبات. تربط الأنسجة نقطة الصفر 457 ملم × 1.3 سم إبرة تحت الجلد بنهاية كل حقنة. قم بإزالة النباتات من غرفة النمو وحقنها بزاوية 90 درجة فوق خط التربة مباشرة.
أدخل إبرة U maus بحذر في جذع نبات تجريبي حتى تصبح في منتصف الساق. حقن ما يقرب من 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. سوف يدفع عبر الجذع ويكون مرئيا أثناء تحركه في دوامة النبات.
استمر في حقن نباتات تجريبية إضافية حتى تفرغ المحاقن. ثم املأها بالماء لتنظيف الإبرة من أي أنسجة نباتية وأعد ملء المحقنة حتى يتم حقن جميع النباتات. استخدم حقنة الماء لحقن محطات التحكم بطريقة مماثلة.
عند اكتمال الحقن. ضع النباتات مرة أخرى في غرفة النمو بشكل يومي. سقي التربة فقط ، وتحقق من تطور مسببات الأمراض وتفاعلات مقاومة النبات.
باستخدام تصنيف تفاعل مقاومة من واحد إلى خمسة ، قم بقياس تفاعلات المقاومة وتسجيلها وتسجيلها لكل نبات بعد 7 و 10 و 14 و 21 يوما من التلقيح أو DPI. تزداد القيم العددية على مقياس التصنيف مع زيادة شدة المرض. على سبيل المثال ، يشير تفاعل المقاومة A1C إلى تفاعل مقاومة واحد أو اثنان من المقاومة.
يشيرتفاعل المقاومة بثلاثة أو أربعة أو خمسة إلى القابلية للإصابة. قارن تفاعلات المقاومة لمحطات التجارب والتحكم واختر النباتات التجريبية ذات تصنيف تفاعل المقاومة A1C واحد أو اثنين. تعتبر هذه النباتات مقاومة للماتيس.
في هذه التجربة ، كانت غالبية النباتات الملقحة بالدبال عرضة للعدوى. أظهرت النباتات تطورا حادا للمرض يتضح من خلال تكوين المرارة الجذعية والقاعدية مع جراثيم تيليو السوداء. ماتت العديد من النباتات بعد التلقيح بسبب شدة المرض.
في المقابل ، كانت محطات التحكم نظيفة جدا ولم تظهر تطور مسببات الأمراض في أي جزء من النبات ، مما يشير إلى أن تطور مسببات الأمراض في النباتات التجريبية كان بسبب تلقيح حقن الإبرة باستخدام U Mais تم تحديد ثلاثة خطوط عدوان متقاطع من Mais Teosinte كانت مقاومة ل U Mais ، وتم التحقق من التلقيح الناجح عن طريق التصلب البسيط ، سماوي في الإنتاج ، أو تكوين مرارة الأوراق الطفيفة. يمكن القيام بهذه التقنية بطريقة عالية الكفاءة مع قابلية التكرار. هذا يساعد في تلقيح وتنميط عدد كبير من النباتات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة حقن بالإبرة لتلقيح نباتات الذرة والتيوزينت بالعامل الممرض الحيوي Ustilago maydis. تتيح هذه التقنية إيصالًا متحكمًا به للعامل الممرض، مما يسهل دخوله إلى النبات من خلال تكوين الضغط المائي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم أمراض النبات
- التفاعلات بين النبات والميكروبات
- تقنيات تلقيح الفطريات
الخلفية
- Ustilago maydis هو عامل ممرض حيوي يؤثر على الذرة.
- تعتبر طرق التلقيح الفعالة ضرورية لدراسة مقاومة النباتات للأمراض.
- توفر حقن الإبرة طريقة دقيقة لتوصيل العامل الممرض.
- يمكن أن يساعد فهم استجابات النبات للعوامل الممرضة في استراتيجيات التربية.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة تلقيح موثوقة لـ Ustilago maydis.
- لفحص خطوط الذرة والتيوزينت لمقاومة المرض.
- لمقارنة ردود الفعل المقاومة بين النباتات التجريبية والنباتات الضابطة.
الطرق المستخدمة
- اختيار خطوط النباتات للتلقيح والفحص.
- زرع البذور للمجموعات التجريبية والضابطة.
- حقن معلق خلايا Ustilago maydis في ساق كل نبات.
- مقارنة ردود الفعل المقاومة للنباتات الملقحة والنباتات الضابطة.
النتائج الرئيسية
- تتيح طريقة حقن الإبرة تلقيحًا قابلًا للتكرار.
- يكشف التصوير الفينوطيبي البصري عن نتائج تلقيح ناجحة.
- يمكن تقييم ردود الفعل المقاومة بشكل فعال بين خطوط النباتات المختلفة.
- تعزز هذه الطريقة فهم تفاعلات النبات-العامل الممرض.
الخلاصات
- تعتبر طريقة حقن الإبرة فعالة لدراسة Ustilago maydis.
- توفر بيئة متحكم بها لتقييم مقاومة النبات.
- تساهم النتائج في فهم أعمق لمقاومة المرض في الذرة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate pathogenicity assessment is critical for identifying disease-resistant crop lines in agricultural biotechnology. This needle injection method enables reproducible delivery of Ustilago maydis, supporting target validation in plant-pathogen interaction studies. The approach facilitates phenotypic screening and mechanistic de-risking for breeding programs focused on biotrophic pathogen resistance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-pathogen interactions through controlled pathogen delivery.
- Operational Value: Provides standardized inoculation for consistent resistance reaction scoring.
- Predictive Value: Supports identification of resistant lines for downstream breeding and trait validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative resistance reaction ratings (1-5 scale) for phenotypic screening.
- Operational Value: Ensures reproducible pathogen delivery between plant leaves, reducing variability.
- Scalability: Compatible with high-throughput inoculation of large plant populations (e.g., 700 plants).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links resistance phenotypes to genetic introgression lines for breeding applications.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables selection of resistant teosinte and maize-teosinte lines for trait stacking.
- Mechanistic De-risking: Clarifies susceptibility vs. resistance phenotypes via visual symptom scoring.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of resistance mechanisms in plant lines prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating pathogen delivery as an independent variable.
- Screening: Delivers standardized inoculum for assay-ready biological systems.
- Analytics: Provides ordinal resistance scores (DPI 7,10,14,21) for quantitative trait correlation.
- Translational Research: Connects resistance reactions to genetic backgrounds in introgression lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple pathogen strains across germplasm panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in pathogenicity assays through direct stem injection.
- Operational Value: Eliminates pathogen penetration barriers, improving infection consistency.
- Strategic Value: Increases confidence in resistance calls by comparing experimental vs. control phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of resistant lines for breeding pipeline advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic fungal culture preparation and plant handling.
- Dependent on sterile syringe and needle instrumentation for precise inoculation.
- Necessitates growth chamber standardization for reproducible environmental conditions.
- Involves adaptation considerations for different plant developmental stages and genotypes.
- Limited to stem injection applicability; not suitable for foliar or root-specific pathogenicity assays.
