كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

الهدف العام من التجربة التالية هو توفير حل سهل ومتعدد الاستخدامات لمراقبة أنواع الأكسجين التفاعلية المختلفة أو ROS وتوطينها وتوفير مزيد من الأفكار حول الآليات الخلوية المتعلقة ب ROS. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء ثلاثة فحوصات مختلفة ، أولها يستخدم الخرز المطلي باللون الأخضر RST أو OB G والفحص المجهري الحي ، و ob g fluorescein ، و Alexa. يقترن الفلور 594 تساهميا بسطح حبات سيكا ثلاثة ميكرون عبر BSA.

يشير انبعاث التألق من فلورسين OBG إلى الأكسدة بواسطة ROS ، بينما تساعد الإشارة من Alexa Fluor 594 في توطين الخرزات وتعمل كعنصر تحكم في القياس الكمي للتألق. تستخدم الطريقة الثانية المسبار الحساس للأكسيد الفائق ثنائي هيدرو الإيثيديوم أو DHE في فحص قائم على قارئ الألواح. نتيجة للأكسدة بواسطة الأكسيد الفائق ، فإن الإيثيديوم قادر على الاندماج في الحمض النووي النووي والميتوكوندريا وقد أدى إلى تحويل ذروة الإثارة والانبعاث عند 522 نانومتر و 605 نانومتر على التوالي.

تتوافق شدة التألق ل AUM مع كمية إنتاج الأكسيد الفائق ، مما يسمح بالقياس الكمي لتوليد الأكسيد الفائق داخل الخلايا في الخلايا. الطريقة الثالثة هي أيضا فحص قائم على قارئ الألواح. يتم استخدام المسبار الحساس لبيروكسيد الهيدروجين بلكس أحمر فائق أو UR لقياس إنتاج بيروكسيد الهيدروجين خارج الخلية كميا.

تتوافق شدة الفلورسنت ل UR OX مع كمية بيروكسيد الهيدروجين المنتج خارج الخلايا. تم الحصول على النتائج التي تظهر توطين التوليد الديناميكي ROS بناء على O-B-G-D-H-E ومقايسات UR. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة مثل OB GSAs القائمة على معدل اللوحة ، هي أنها تصور ديناميكيا جيل Al Roth على مستوى الخلية الواحدة.

بدلا من النسخ المتطابق ومتوسط إشارة روث من مجموعة من الخلايا. تميل طرق حساب متوسط السكان هذه إلى حجب المعلومات الهامة بسبب البلعمة غير المتزامنة. لبدء إجراء ترميز الخرز باستخدام أوكسي أو بيرت جرين أو OBG ، أضف ملليلترا واحدا من معلق حبات السيليكا الكربوكسية 3.0 ميكرون في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتدوير الأنبوب بسرعة وإزالة المادة الطافية أضف ملليلتر واحد من PBS والدوامة بهذه الطريقة. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام PBS.

بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرز. في مليلتر واحد من PBS يحتوي على 25 ملليغرام لكل مليلتر من السيانيد ، يجب تحضير محلول السيانيد طازجا في كل مرة قبل استخدامه احتضان على عجلة لمدة 15 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى تنشيط حبات السيليكا ذات الكربوكسيل لربط BSA المسمى مسبقا تساهميا بعد 15 دقيقة ، والطرد المركزي للأنبوب ، وإزالة المادة الطافية.

أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للاقتران وغسل الدوامة ثلاث مرات باستخدام عازلة اقتران عن طريق الدوران السريع والدوامة لإزالة السيانيد الزائد ، واخلط الخرزات المغسولة مع 500 ميكرولتر من عازلة التوصيل التي تحتوي على ملليغرام واحد من OBGH اثنين H-F-F-B-S-A ثم املأ الأنبوب بغاز النيتروجين من علبة غاز قياسية. بعد تغطية الأنبوب المحتضن على عجلة لمدة 14 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام في اليوم التالي ، قم بإخماد OBG غير التفاعلي عن طريق غسل الخرزات مرتين باستخدام مليلتر واحد من مخزن التبريد عن طريق الدوران السريع والدوامة ثم اغسله مرتين باستخدام مخزن مؤقت للاقتران لإزالة المخزن المؤقت للتبريد. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للاقتران الذي يحتوي على 50 ميكروغراما من LOR 594 cin إستر متوسط ليقترن ب BSA.

املأ الأنبوب بغطاء النيتروجين واحتضنه على عجلة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نهاية الحضانة لمدة 1.5 ساعة ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من محلول التبريد. يتبع ذلك غسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS.

أخيرا ، راي ، قم بتعليق الخرزات في مليلتر واحد من PBS مع ميكرولترين بوزن 10٪ لكل حجم. Azide للتخزين طويل الأجل. قم بقياس تركيز الخرزات في التعليق باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، وعادة ما يكون من مرة إلى مرتين 10 إلى الخرزات التاسعة لكل مليلتر.

املأ الأنبوب بغطاء النيتروجين وقم بتخزينه أربع درجات مئوية في الظلام. ابدأ هذا الإجراء عن طريق حصاد خلايا الأليوم التي تنمو بشكل كبير من طبق بتري 10 سم. كثافات مختلفة من الخلايا على أطباق ثلاثة سنتيمترات ذات قاع بلاستيكي أو زجاجي شفاف بصريا وتنمو بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.

اختر الأطباق التي تتماسك حوالي 80٪ لاستخدامها في التجربة. استبدل وسط المزرعة بتدفق منخفض أو وسط LF واحتضانه لمدة ساعتين قبل التجربة من أجل تقليل التألق الذاتي خارج الخلية وداخل وسط ثقافة HL five C. قم بإذابة 10 ملليلتر من أجار 1.5٪ BDO في وسط LF ، واسكب الأجار على سطح مستو لتشكيل طبقة أجار بسمك حوالي ملليمتر واحد.

انتظر لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى يتجمد الأجار. تقطع طبقة الأجار إلى مربعين في سنتيمترين وتوضع في وسط LF لوقت لاحق. استخدام. إصلاح المجهر واسع المجهر.

اضبط درجة حرارة الغرفة البيئية على 22 درجة مئوية واضبط الإعدادات المطلوبة للتجربة. بعد ساعتين من الحضانة ، استنشق وسط LF من الطبق الذي يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات ، لكن اترك طبقة أحادية الخلية مغطاة بغشاء رقيق من المتوسط. خفف الخرزات المطلية ب OBG المعدة مسبقا إلى 1.5 مرة 10 إلى الخرزات السابعة لكل مليلتر وأضف 10 ميكرولتر إلى طبقة الخلية.

خذ ورقة أجار مربعة واحدة وصفي أي سائل زائد ، لكن حافظ على الأجار رطبا. ضع مربع أجار برفق فوق طبقة الخلية. يزيد تراكب الأجار من التلامس بين الخرز والخلايا ، وبالتالي تحسين الامتصاص.

كما أنه يضغط الخلايا قليلا ، مما يجعلها أفضل في المستوى البؤري للهدف. ضع الغطاء على الطبق لنجاح التجربة. لا تحرك تراكب AGA عندما يغطي الخلايا ، كما أنه من الأهمية بمكان بدء خطوة التصوير على الفور.

بعد ذلك ، ضع الطبق على مرحلة المجهر والتقط صورا تلقائيا في القنوات الحمراء والخضراء والطورية كل دقيقة لمدة ساعتين أو أكثر. لقياس إنتاج ROS ، حدد الأحداث الخلوية التي تحتوي على عملية البلعمة بأكملها وركز عليها. باستخدام برنامج معالجة الصور الاحترافي ، ادمج القنوات الثلاث المحسنة وقم بتجميع الصور في فيلم.

حدد كثافة التألق لكل من الخرزات المحددة في القناتين الحمراء والخضراء. ستعكس نسبة الأحمر إلى الأخضر إنتاج FOMO R OS الديناميكي للخلايا. لقياس إنتاج الأكسيد الفائق داخل الخلايا أولا ، اجمع 180٪ طبق ملتقى من الأليوم في 10 ملليلتر من HL خمسة C متوسط التالي خلايا الأليوم بالطرد المركزي في 850 مرة G لمدة خمس دقائق وشفط بعناية وبشكل كامل الخلايا المعلقة المتوسطة في خلايا العد العازلة SS 6.4 وتخفيفها إلى كثافة نهائية ستة في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر.

أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة بيضاء غير شفافة 96 بئر مخففة ثنائي هيدرو إيثيديوم أو مخزون DHE 500 أضعاف مع SS 6.4 عازلة. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 50 ميكرولترا من DHE المخفف في كل بئر من لوحة البئر 96. التركيز النهائي ل DHE هو 30 ميكرومولار.

سيبدأ رد الفعل على الفور. يمكن إضافة المحفزات أو المثبطات في هذه المرحلة أو في نقاط زمنية أخرى وفقا للاحتياجات المحددة. احتضان الخلايا مع اهتزاز متوسط عند 22 درجة مئوية.

اقرأ التألق باستخدام قارئ صفيحة مضان كل دقيقتين لمدة ساعة واحدة. استخدم وضع القراءة العلوية لنقطة النهاية مع إثارة التألق عند 522 نانومتر والانبعاث عند 605 نانومتر. ابدأ هذا الإجراء بإعداد صفيحة 96 بئر بخلايا ديوم كما هو موضح في الجزء السابق.

قم بإعداد بيروكسيداز فجل الحصان المخفف أو HRP عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من مخزون HRP إلى 10 مل من المخزن المؤقت SS 6.4. اقلب الأنبوب ليخلط جيدا ويبقى على الثلج. محلول HRP المخفف هو 0.05 وحدة لكل مليلتر.

قم بإعداد خليط تفاعل UR أو UR عن طريق خلط مخزون UR ومحلول HRP المخفف في محلول SS 6.4 إلى التركيزات النهائية 6.25. ميكرومولار أ UR و 0.005 وحدة في المليلتر. أضف HRP 50 ميكرولترا من خليط UR في كل بئر.

سيبدأ رد الفعل على الفور. يمكن إضافة المحفزات أو المثبطات في هذه المرحلة أو في نقاط زمنية أخرى وفقا للاحتياجات المحددة. احتضان الخلايا مع اهتزاز متوسط عند 22 درجة مئوية.

اقرأ التألق باستخدام قارئ صفيحة مضان كل دقيقتين لمدة ساعة واحدة. استخدم وضع القراءة العلوية لنقطة النهاية مع إثارة التألق عند 530 نانومتر والانبعاث عند 590 نانومتر. يتم اختبار كفاءة طلاء OB g fluorescein باستخدام بيروكسيد الهيدروجين و HRP لأكسدة الخرز المطلي في المختبر وفحص طيف الانبعاث باستخدام الإثارة عند 500 نانومتر.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، تظهر الخرزات المؤكسدة ذروة انبعاث كبيرة عند 538 نانومتر مقارنة بالخرز غير المؤكسد بنسبة شدة لا تقل عن 11 إلى 12 ضعفا. يمكن تصور توليد ROS في البلعمات في خلايا الديوم نوعيا وديناميكيا عن طريق الفحص المجهري كما هو موضح في هذا الفيلم التمثيلي بفاصل زمني مسجل لمدة 40 دقيقة باستخدام تكبير ستة × خلال الدقيقة الأولى بعد الارتفاع. عن طريق البلعمة ، تغير تألق الخرز المطلي بالفلور OBG من الأحمر إلى البرتقالي الفاتح مما يشير إلى أنه من المحتمل أن يتم إنتاج ROS مباشرة داخل البلعمة.

يتم قياس إنتاج بيروكسيد الهيدروجين داخل الخلايا وبيروكسيد الهيدروجين خارج الخلية كميا بواسطة فحوصات DHE و UR على التوالي. يتم عرض ملخص للتفاعلات الكيميائية الحيوية المتعلقة بهذين المقياسين. يتم تحويل الأكسيد الفائق إلى بيروكسيد الهيدروجين عن طريق أكسيد الفائق أو SOD ويتم تحويل بيروكسيد الهيدروجين إلى ماء وأكسجين بواسطة الكاتلاز في اختبار DHE.

يتم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة للقياس الكمي متوسط الإنتاجية للأكسيد الفائق داخل الخلايا. تظهر تجربة تمثيلية أنه عند تحفيزه بعديدات السكاريد الدهنية LPSA من الإشريكية القولونية ، فإن إنتاج الأكسيد الفائق الديناميكي من خليتين AX أعلى بكثير من المستوى القاعدي من خليتين AX غير المحفزتين وخلفية التفاعل في المخزن المؤقت ، يرتبط انخفاض التألق الأزرق وزيادة التألق الأحمر عكسيا. كما هو متوقع.

تأكيد توطين إنتاج R os المقاس بواسطة مقايسة DHE من خلال النتائج التالية. إضافة إضافة مثبط ديسموتاز الأكسيد الفائق الثابت لغشاء D-E-D-T-C-A زاد من إشارة DHE بطريقة تعتمد على الجرعة مما يشير إلى أن D-E-D-T-C تسبب في تراكم ركيزة ديسموتاز الأكسيد الفائق. بدلا من ذلك ، لم تؤثر إضافة مروي بيروكسيد الهيدروجين الغشائي IMP على إنتاج الأكسيد الفائق في مقايسة A UR.

يتم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة للقياس الكمي متوسط الإنتاجية لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين خارج الخلية. تظهر تجربة تمثيلية أنه عند تحفيزها باستخدام LPS ، يكون إنتاج بيروكسيد الهيدروجين الديناميكي من خليتين AX أعلى بكثير من المستوى القاعدي من خليتين AX غير المحفزتين ورد فعل الخلفية عند معالجته بتركيزات مختلفة من D-E-D-T-C أو الكاتلاز ، تنخفض إشارة A UR بطريقة تعتمد على الجرعة بسبب تثبيط إنتاج بيروكسيد الهيدروجين من الأكسيد الفائق داخل الخلايا واستنفاد بيروكسيد الهيدروجين خارج الخلية على التوالي. أكدت العلاجات باستخدام D-E-D-T-C والكاتالاز صراحة أن فحوصات DHE و UR تقيس على وجه التحديد أنواعا مختلفة وتوطين تحت الخلايا ل ROS Indicum بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل عكس توليد روس أثناء الإصابة بالبكتيريا المسببة للأمراض أو غير المسببة للأمراض من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية استجابة الفحل الديكتالي لعدوى البكتيريا المختلفة من حيث توليد الخسارة. ولا تنس أن العمل مع البكتيريا المسببة للأمراض مثل البكتيريا الدقيقة marum يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل BSL المناسب وإجراءين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.