مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خريطة ثنائية الأبعاد للبروتيوم البكتيري. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة مزرعة بكتيرية أولاً ثم حصاد البروتينات. بعد ذلك، يتم فصل البروتينات المحصودة في بعد واحد وفقاً لدرجة pH الخاصة بها.

عن طريق التركيز المتساوي التكهرب فيما بعد فصل البعد الأول، يتم فصل البروتينات بشكل أكبر في البعد الثاني وفقاً لوزنها الجزيئي. وفي النهاية، يتم صبغ هلام البعد الثاني وتصوير البروتينات. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في التعبير البروتيني من خلال الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الإمراض البكتيري، مثل ما هي البروتينات التي يتم إنتاجها في ظل ظروف معينة، وكيف تختلف العزلات البكتيرية المختلفة في إنتاج البروتين؟ يمكن لهذه المعلومات أن تساعد في تحديد البروتينات المرشحة التي قد تكون متورطة في الضراوة. بعد تنمية مزرعة بكتيرية من منتجات الألبان الباردة بحجم 100 milliliter حتى تصل إلى طور الثبات، انقل 35 milliliters إلى أنبوب طرد مركزي وقم بتدويره عند 4, 500 Gs ودرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 20 دقيقة.

أعد تعليق الراسب في 35 ملليلتر من PBS البارد وكرر عملية الطرد المركزي. بعد إعادة تعليق الراسب في ملليلتر واحد من PBS البارد، انقل المحلول إلى أنبوب دقيق معقم سعة ملليلترين وقم بالطرد المركزي مرة أخرى. كرر عملية الغسل في ملليلتر واحد من PBS البارد قبل الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C وقوة 14,000 Gs لمدة دقيقة واحدة، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف ملليلتر واحد من محلول P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F، وانقل الراسب المذاب إلى أنبوب ذو غطاء لولبي سعة ملليلترين يحتوي على حوالي 0.5 ملليلتر من الخرز الزجاجي المعقم مسبقاً.

بعد ذلك، وفي الغرفة الباردة، ولتفكيك الخلايا، استخدم جهاز طحن الخرز الصغير (mini bead beader) ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة في كل مرة، مع وضع العينة على الثلج بعد كل جولة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة قبل نقل السائل الطافي إلى أنبوب بوليسترين معقم سعة 5 mL. ولزيادة الحصيلة، كرر عملية طحن الخرز مرتين مع إضافة كمية أخرى من P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. ثم اسحب العينات.

بعد تقدير كمية البروتين، يتم تخزين حصص مقدارها 200 microgram في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت استخدامها لإجراء البعد الأول. يبدأ التركيز المتساوي الكهربائي أو IEF باستخدام محلول تنظيف الشرائط لتنظيف حوامل الشرائط، يليه شطف الشرائط بماء milli Q.

ثم اتركها مقلوبة لتجف، وبعد التجفيف، خصص رقماً لكل عينة في حامل شرائح الجل. قم بتحميل عينة بروتين مُعدة مسبقاً بتركيز 200 microgram في البئر الجانبي لحامل الشرائح، واستخدم الماصة لتوزيع العينة على طول الحامل باستخدام ملقط نظيف. اسحب شرائح الجل من العبوة.

بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة الواقية من شرائح الهلام قبل رصها بحيث يكون الجانب الخشن لأسفل بحركة انزلاقية بطيئة لترطيب الشرائح من الطرف السالب إلى الطرف الموجب. ولمنع الاحتراق، ضع ورق ترشيح مبللاً بالماء المعقم فوق القطب الكهربائي وتحت شرائح الهلام. قم بإزالة الفقاعات الهوائية وتغطيتها بطبقة رقيقة من الزيت المعدني لمنع الجفاف.

قم بمحاذاة حوامل شرائح الهلام على جهاز التركيز التعادل الكهربائي (IEF). قم بتشغيل العينات باستخدام البرنامج المدرج هنا. يمكن إزالة شرائح الهلام في أي وقت خلال الخطوة الأخيرة.

عند اكتمال البرنامج، قم بإزالة الشرائط من حاملات الشرائط، وما لم يتم استخدامها على الفور، قم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي وتخزينها عند درجة حرارة 80- °C حتى يحين موعد إجراء SDS page ثنائي الأبعاد. بعد تجميع جهاز صب الهلام لـ SDS page، قم بتحضير محلول الهلام في دورق مزود بطرف تفريغ وقضيب تحريك عن طريق إضافة خليط من tris buffer بتركيز 1.5 molar ومياه MCU، ثم قم بتفريغ المحلول من الغازات بسرعة متوسطة باستخدام جهاز التفريغ لمدة 20 دقيقة. عند انتهاء عملية التفريغ، أضف 10% SDS إلى محلول الهلام عن طريق نقطه على جدار الدورق. ولتجنب إدخال فقاعات، أضف بعد ذلك كبريتات الأمونيوم والـ temid المحضرة حديثاً ثم قم بالتحريك.

صُب الهلام واتركه حتى يتصلب، ثم أذب DTT في محلول الموازنة المُحضّر مسبقاً. أخرج الشرائط من التخزين عند درجة حرارة 80- °C، وقم بفك تغليفها ثم ضع شرائط IPG بحيث يكون جانب الهلام للأسفل في المحلول المنظم واتركها لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، أضف 4.5 liters من محلول الفصل الكهربائي المنظم إلى خزان التشغيل.

بعد ذلك، استخدم الملاقط لإزالة الشرائح من محلول التوازن، واستخدم منشفة ورقية لتجفيف الفائض من المنظم. قم بتفكيك جهاز صب الهلام واغسل الألواح الزجاجية بالماء الدافئ. بعد استبدال الماء الموجود أعلى الهلام بـ running buffer، استخدم ملاقط نظيفة لوضع شريحة فوق اللوح الطويل بحيث يكون جانب الهلام مواجهاً إليك.

قم بتزييت الشريط باستخدام one x buffer واستخدم شريطاً بلاستيكياً لدفع شريط IPG إلى الأسفل أكثر مقابل الهلام، مع إزالة جميع فقاعات الهواء الموجودة بين الشريط والهلام. أضف agarro sealing solution إلى الجزء العلوي من الشريط لتثبيته في مكانه. بعد ذلك، وبعد تكرار هذه العملية لجميع الشرائط، قم بإنزالها في خزان الهلام.

بعد التأكد من أن مستوى محلول المنظم 1x في الحجرة الخارجية عند المستوى المحدد، قم بتركيب الحجرة العلوية. ضع إطار حجرة المنظم العلوية فوق الألواح الزجاجية واضغط لأسفل. أضف محلول المنظم التشغيلي 2x في الحجرة العلوية حتى الخط الأوسط.

ثم أضف محلول التشغيل بتركيز 1x إلى الحجرة الخارجية حتى يصل إلى الخط العلوي. ضع الغطاء في الأعلى ثم قم بتشغيل وحدة الفصل الكهربائي ووحدة إمداد الطاقة. قم بتشغيل العينات طوال الليل عند 52 volts و96 milliamps وfive watts.

قم بتشغيل الهلام حتى تصل الخطوط الرائدة إلى مسافة سنتيمتر واحد من القاع. بعد انتهاء وقت التشغيل، أخرج الألواح من جهاز الصب. وبمجرد إزالة الهلام من الألواح الزجاجية، قم بتثبيتها في المحلول الأول لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

ثم انقل الهلامات إلى محلول التثبيت الثاني مع الرج لمدة ساعة واحدة. اغسل الهلامات في ماء Milli Q أربع مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة. بعد ذلك، استخدم محلول نترات الفضة لصبغ الهلامات لمدة 30 دقيقة أو حتى 48 ساعة.

بعد غسل الهلامات لمدة دقيقة واحدة في ماء Milli Q، يتم نقلها إلى محلول المظهر حتى يتصبغ الهلام. وبعد مرور حوالي 5 إلى 30 دقيقة، ولإيقاف التفاعل، يتم نقل الهلامات إلى محلول الإيقاف لمدة 10 دقائق. يظهر هنا هلام مصبوغ بـ Kumasi Blues لاستخلاصات البروتين من خلايا كاملة لـ ol dia multivorans.

تم إنماء العزلات السريرية إما في مرق LB أو مرق مانيتول الخميرة وحصادها في طور الثبات. وقد أظهر التحليل المقارن لملفات البروتين المستخلصة من نفس المزارع البكتيرية في مناسبتين مختلفتين أنماط نطاقات متشابهة، مما يشير إلى نجاح عمليات استخلاص البروتين. ويظهر في هذا الشكل تحليل الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد لـ 200 micrograms من البروتين الكلي من Bural dio, pseudo وفرة تزيد عن 500 بقعة يمكن تحديدها بشكل فردي عن طريق مطياف الكتلة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي (cytometry) من أجل تحديد الاختلافات الكمية والنوعية بين العزلات البكتيرية المتقاربة. بالإضافة إلى ذلك، ومن خلال إجراء تعديل على طريقة الصبغ، يمكن للباحثين تحديد هوية بقع البروتين عن طريق استئصال البقعة والتحليل الطيفي للكتلة.