معطفا البذور الفراش الفحص لاستكشاف وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد مقايسة لفرشة غلاف البذور لاستكشاف كيفية تحكم السويداء في إنبات البذور في نبات rabbit opsis استجابةً لمختلف الظروف البيئية على المستويين الجيني والمخبري. ويتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام إبرة حقنة وملقط مقصوص لتشريح غلاف البذرة والجنين بعناية من بذرة Arab Opsis. وفي الخطوة الثانية، يتم نقل أغلفة البذور المشرحة برفق إلى وسط الإنبات.

بعد ذلك، يتم تجميع أغلفة البذور في طبقة دائرية واحدة. وفي الخطوة النهائية، يتم ترتيب الأجنة في مركز سرير أغلفة البذور المجمعة، وذلك أيضاً في طبقة دائرية واحدة.

يلعب السويداء دوراً أساسياً في التحكم في إنبات البذور في بذورنا التي تخضع للتشريح. ويعد اختبار انثناء غلاف البذرة إجراءً لنظام وراثي في المختبر لتحديد المكونات الوراثية الجزيئية لمسارات الإشارات التي تعمل في السويداء للتحكم في إنبات البذور. وبشكل عام، يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن تشريح الجنين بسرعة ودون إتلافه يعد أمراً صعباً.

من المهم أيضاً مراعاة عمر المادة المستخدمة، حيث تميل إلى فقدان القدرة على التحكم في تحديد الخلايا مع تقدمها في السن. ابدأ بسكب من 50 إلى 60 µL من بذور Arab opsis الجافة والناضجة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. ثم أضف 1 mL من ethanol بتركيز 70% إلى الأنبوب ورج البذور في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز vortex مضبوط على 1200 RPM. بعد 10 دقائق، قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة ثلاث ثوانٍ عند 4,000 Gs لتركيز البذور في قاع الأنبوب.

بعد ذلك، استخدم رأس شفط مفرغ لسحب الإيثانول بعناية، مع ترك البذور في قاع الأنبوب. الآن، أضف 1 mL من الماء المقطر المعقم إلى البذور، ثم رج البذور لمدة 10 دقائق أخرى. بعد تدوير البذور مرة أخرى لترسيبها، اشفط السائل وأضف 1 mL آخر من الماء المقطر المعقم إلى الأنبوب، مع التأكد من أن تدفق الماء يوزع البذور بشكل متجانس في جميع أنحاء الأنبوب.

ثم ضع الأنبوب في حامل للسماح للبذور بالترسب في قاع الأنبوب. وبعد حوالي 30 ثانية، قم بشفط الماء بعناية لنقل البذور إلى الأطباق. أولاً، صب 30 milliliters من وسط الإنبات المحضر حديثاً عند درجة حرارة 50 °C في طبق بتري سعة 100 millimeter. أعد تعليق البذور في 200 µL من الماء المقطر المعقم، ثم استخدم طرف ماصة دقيقة سعة 1 milliliter لنقلها إلى سطح وسط الإنبات.

قم بشفط الماء المحيط بالبذور، ثم اترك طبق بتري والبذور مكشوفين داخل كابينة التدفق الصفائحي لمزيد من التجفيف. بعد مرور ساعتين، أغلق طبق بتري مع ترك البذور داخل الكابينة لمدة 90 دقيقة أخرى. الآن، ضع مجهراً ستيريو داخل الكابينة.

صُب 30 milliliters من وسط الإنبات في طبق بتري آخر بقطر 100 millimeter، ثم ضع ورقتين مستطيلتين متجاورين من ورق watman بقطر ثلاثة مليمترات ومعقمتين بجهاز التعقيم (autoclave) على سطح الوسط. إن أصعب خطوة في هذا الإجراء هي التشريح، لأن البذرة رقيقة جداً، لذا من الضروري توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف الجنين عند قطع البذرة التي يتم الإمساك بها باستخدام ملقط dumont معقم ذو طرف غير مدبب، رقم خمسة.

انقل البذور إلى الأوراق، ثم أمسك الملقط مغلقاً. اضغط برفق على كل بذرة بشكل فردي داخل الورقة. الآن، استخدم طرف إبرة حقنة إنسولين عيار 29 لشق غلاف البذرة على طول المحور شبه الرئيسي الأطول، وبأقرب قدر ممكن من المكان الذي تتصل فيه الموصلات الجنينية بالجذير.

استخدم بعد ذلك الملقط لضغط البذرة مقابل الورقة. ومرة أخرى، قم بتطبيق الضغط عند طرف الـ Cains الأقرب إلى طرف الجذير لتحرير الجنين من غلاف البذرة لتجميع مقايسة سرير غلاف البذرة. أولاً، ضع قطعة من شبكة النايلون المعقمة بمقاس 3.5 في 5 cm في طبق آخر بقطر 100 mm من وسط الإنبات المصبوب حديثاً.

بعد ذلك، استخدم المحقنة لدفع الأجنة وأغلفة البذور برفق نحو الحواف المعدنية للملقط ونقل الأنسجة النباتية إلى الشبكة النايلونية. استخدم الملقط والمحقنة لتجميع طبقة دائرية واحدة من أغلفة البذور، مع التأكد من أن الأغلفة متقاربة قدر الإمكان، وأن الفتحات الموجودة في أغلفة البذور متجهة للأعلى. ثم ضع الأجنة في طبقة دائرية واحدة في مركز سرير أغلفة البذور، مع ضمان أن تكون الأجنة أيضاً متقاربة قدر الإمكان.

أخيرًا، يتم تحضين اختبارات فرشة البذور تحت إضاءة مستمرة في درجة حرارة من 20 إلى 21 درجة Celsius بما يتوافق مع النتائج السابقة. بذور طفرة rabbit opsys غير القادرة على تخليق gier illin أو الطفرات الناقصة في GA لا يمكنها الإنبات بعد 80 ساعة من تثبيط البذور. وفي المقابل، وبما يتوافق أكثر مع النتائج السابقة، فإن إزالة غلاف البذرة يحفز نمو جنين الطفرة الناقصة في GA ما لم يكن OB CIC acid أو BA موجودًا في الوسط، مما يشير إلى أن السويداء في الطفرات الناقصة في GA تفرز BA باتجاه الجنين لمنع إنباته.

تظهر هذه الصورة، بعد مرور 80 ساعة من تثبيط البذور، اختبار فرش غلاف البذور باستخدام أجنة طافرة ناقصة في GA على فرش مكون من 80 غلاف بذور طافرة ناقصة في GA. وتماشياً مع فرضيتنا، فإن أغلفة البذور الطافرة الناقصة في GA تمنع نمو الأجنة الطافرة الناقصة في GA. يظهر هنا اختبار فرش غلاف البذور باستخدام أجنة طافرة ناقصة في GA مستنبتة على فرش من أغلفة بذور طافرة ناقصة في GA تفتقر أيضاً إلى القدرة على تخليق A BA بعد 80 ساعة من تثبيط البذور؛ وكما هو متوقع، تكون أغلفة البذور الطافرة غير قادرة على منع نمو الأجنة الطافرة الناقصة في GA.

وبالمثل، فإن الأجنة الطافرة الناقصة في GA والتي تم استزراعها على طبقة من أغلفة البذور الطافرة الناقصة في GA والتي تفتقر إلى العامل RGL2، لم تكن قادرة أيضاً على وقف نمو الأجنة الطافرة الناقصة في GA بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى، مثل تحليل التعبير الجيني من غلاف البذرة والجنين المستخرج من البذرة، من أجل استقصاء التفاعل الجيني باستخدام تقنية تحميم غلاف البذور. لذا، وبمجرد إتقان هذه التقنية، فإنها ستسمح للباحثين في مجال إنبات البذور باستكشاف كيفية تحكم غلاف البذور في النمو الجنيني استجابةً للإشارات البيئية في نظامنا.