تحديد البكتيريا عملية الأيض نشطة في الوتر من اختصاصي ورق القطن littoralis عن طريق الحمض النووي النظائر مستقرة جس طريق ¹³ C-الجلوكوز

الهدف العام من التجربة التالية هو تفصيل منهجية فعالة مستخدمة لتوصيف البكتيريا النشطة الأيضية وراثيا في أمعاء الحشرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطعام الجلوكوز المسمى C 13 أولا للحشرة لإثراء الحمض النووي للبكتيريا النشطة الأيضية في أمعائها. الخطوة التالية هي استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري الموجود في الأمعاء.

الخطوة الثالثة هي فصل الحمض النووي للأنواع النشطة الأيضية ، والتي دمجت C 13. ثم يتم تحديد الحمض النووي بشكل نشوينية وقياسه كميا للأنواع الموجودة عن طريق تسلسل بايرو. وبالتالي تحديد الأنواع البكتيرية النشطة الأيضية التي تشكل المجتمع الموجود في أمعاء الحشرات.

لذا فإن أمعاء الكائن متعدد الخلايا هو اختراع مبتكر لاستغلال القدرات الأيضية للكائنات الحية الدقيقة لإذابة أو إذابة المواد العضوية المعقدة بحيث يمكن أن تكون بمثابة مغذيات لمضيف الحشرات. لفهم النظام ، علينا أولا تحليل من هو موجود هناك ، وثانيا من لديه أي من الأنشطة الأيضية. إذا كانت لدينا هذه البيانات ، فيمكننا إعادة بناء تدفق المستقلبات ومنتجات التحلل بين الكائنات الحية الدقيقة المهينة ومضيف الحشرات.

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة الميكروبية ، لا سيما في الطريقة التي تتفاعل بها هذه الميكروبات مع مضيفها. بهذا المعنى ، يمكننا معرفة المزيد وتوضيح وتحديد الوظائف التي تخدمها هذه الكائنات الحية لمضيفها. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبكتيريا الأمعاء النشطة العامة.

من خلال تتبع الجلوكوز ، يمكن أيضا إجراؤه إلى مصدر كربون آخر ، مثل وضع العلامات على cellose لتحديد البكتيريا النشطة المشاركة في عملية هضم المغذيات المثمنة. حافظ على التيرات والبيض وأطباق بتري تضيف درجة حرارة الغرفة حتى تفقس. ثم انقل اليرقات حديثة الفقس إلى صندوق بلاستيكي نظيف وقم بتربيتها على نظام غذائي اصطناعي عند 23 إلى 25 درجة مئوية تحت نظام نهار طويل مع 16 ساعة من الإضاءة وثماني ساعات من الظلام بعد بضعة أيام ، انقل تسعة إلى 15 يرقات صحية من الطور الثاني من صندوق التربية إلى أطباق بتري الفردية التي تحتوي على جلوكوز C 13 الطازج.

النظام الغذائي الاصطناعي المسنن ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن ثلاثة نسخ مكررة من ثلاث يرقات لكل علاج. استخدم نظاما غذائيا اصطناعيا يوفر نفس كمية الجلوكوز الأصلي كمصدر غذائي طبيعي مثل القطن لإطعام المجموعة الضابطة. خلال ال 24 ساعة القادمة.

الوجبات الغذائية الاصطناعية بشكل متكرر. ابدأ بنقل اليرقات بالملقط الناعم إلى بركة من الماء المقطر لإزالة الحطام الكبير. ثم انقله إلى طبق نظيف جديد لتخدير الحشرات وقتلها.

ضعها على الجليد ثم اخفض درجة الحرارة إلى سالب خمس درجات مئوية في المبرد. ثم قم بتطهير الحشرات الميتة بنسبة 70٪ من الإيثانول واغمرها في PBS للتشريح. يجب أيضا تنظيف الأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ابدأ بشقوق في البشرة على طول الجانبين الأيمن والأيسر. ابدأ على الرأس وانتهي على فتحة الشرج. قم بإزالة الهيكل الخارجي بالكامل والأنابيب المالية والجسم الدهني.

ثم استبدل المخزن المؤقت قبل فتح القناة الهضمية بالأمعاء المعزولة عن الأنسجة الأخرى. قم بمعالجة القناة الهضمية بأكملها أو أقسام الأمعاء الوسطى أو الأمعاء الخلفية. اعتمادا على السؤال العلمي.

انقل أنسجة الأمعاء بدون PBS إلى أنبوب صغير معقم وقم بتخزينها في الفريزر. قبل استخراج الحمض النووي ، جفف العينات عند 45 درجة مئوية في جهاز مكثف فراغي لمدة 30 إلى 90 دقيقة ، اعتمادا على حجم الأنسجة. بعد ذلك ، قم بسحق الأنسجة المجففة باستخدام بلاستيك معقم Pele لاستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة لاستخراج الحمض النووي في التربة.

ثم حدد تركيز الحمض النووي النهائي المستوغ باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحقق من الاستخراج الناجح للحمض النووي الميتاجينومي الميكروبي من أمعاء الحشرات عن طريق إعداد اختبار PCR التشخيصي باستخدام البادئات العامة البكتيرية 27 F و 1 ، 492 R. للتشخيص. قم بتشغيل خمسة ميكرولترات من كل منتج من منتجات PCR على جل agros 1٪ عند 300 فولت و 115 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة تقريبا.

الحجم الصحيح للأمبليكونات هو 1.5 كيلوقاعد. اسحب الحمض النووي المستخرج المقابل لكل تكرار تجريبي معا. إبقاء أولئك الذين لديهم أو بدون جلوكوز C 13 منفصلين.

تطبيع تركيزات الحمض النووي للتأكد من أن كل عينة تساهم بالتساوي في مجموعتها. التركيز النهائي من 500 إلى 5،000 نانوغرام من الحمض النووي مناسب لعملية الطرد المركزي الفائق. تحقق مرة أخرى من التركيز المتوقع باستخدام مقياس الطيف الضوئي في أنبوب غطاء لولبي معقم سعة 15 مل.

قم بإعداد وسيط التدرج. اجمع بين الحمض النووي المقاس كميا مع 4.8 مل من محلول كلوريد السيزيوم. ثم قم بتعبئة الحجم بستة ملليلتر من المخزن المؤقت المتدرج.

انقل الخلائط بعناية إلى أنابيب طرد مركزي فائق سعة 5.1 ملليلتر. باستخدام حقنة وإبرة ، املأ الأنابيب حتى قاعدة رقبتهم وتجنب الضخ أو تشكيل أي فقاعات هواء. قم بتضمين تدرج فارغ واحد على الأقل بدون DNA في كل تشغيل.

لتكون بمثابة تدرج مرجعي ، حدد أزواج من الأنابيب وقم بموازنتها في حدود 10 ملليغرام. ضع غطاء أنبوب على كل أنبوب وتأكد من خلو التسرب عن طريق قلب الأنبوب وتطبيق ضغط معتدل يدويا. استخدم دوار رأسيا قريبا به ثمانية آبار.

أغلق الآبار الدوارة بعناية وقم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتدوير الحمض النووي لأسفل عند 50،000 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية تحت فراغ لمدة 40 ساعة. حدد الحد الأقصى للتسارع والتباطؤ دون الكبح.

بعد يومين ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من دوار جهاز الطرد المركزي باستخدام ملقط. ضعها في رف دون إزعاج التدرجات المشكلة وقم بمعالجة الأنابيب على الفور. قم أولا بموازنة HPLC باستخدام معدل تدفق 850 ميكرولتر في الدقيقة.

ثم قم بتوصيل أنبوب الطرد المركزي الفائق بحامل المشبك واثقب الجزء السفلي من الأنبوب بإبرة قياس 23 بوصة واحدة متصلة بحقنة. لذا اخترق الجزء العلوي من الأنبوب بعناية باستخدام عامل منجم تحكم لمنع إزعاج الشكل والتدرج والممارسة مسبقا لضمان حركة PSA ناجحة. بعد ذلك ، أدخل الإبرة المتصلة بأنبوب المضخة في الجزء العلوي من الأنبوب حيث لا يوجد سائل وجمع القطرات من الأسفل مباشرة إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مليلتر تجمع جزءا كل 30 ثانية مقابل 425 ميكرولتر لكل كسر.

في هذا المثال، يتم جمع 12 كسرا من كل تدرج. بعد ذلك ، قم بقياس كثافة كل كسر منفصل على ميزان تحليلي. تابع استعادة الحمض النووي وتسلسل pyro من خلال الرجوع إلى بروتوكول النص لمدة 24 ساعة.

تم استكمال 10 ملليمولار C 13 جلوكوز في النظام الغذائي لتر ssop. اليرقه. تمت إضافة نفس الكمية من الجلوكوز الطبيعي إلى طعام الحشرات المكافحة. بعد ذلك تم استخراج الحمض النووي من المجتمع البكتيري لأمعاء الحشرات.

على هلام الرحلان الكهربائي ، أكدت مجموعة قوية من الحمض النووي الجيني في الأعلى استخراج الحمض النووي الناجح ، وهو تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي. أظهر استخدام البادئات العالمية البكتيرية وجود تسلسل بايرو الكمي للحمض النووي البكتيري تم إجراؤه مباشرة على تدرجات SIP التمثيلية للكشف عن نسب الأنواع ووفرة نسبية. تم إنشاء ما مجموعه 120،045 قراءة عالية الجودة بمتوسط طول 404 OTs.

أظهر ملف تعريف تسلسل pyro وفرة متزايدة من أنواع معينة ، بما في ذلك المكورات المعوية والبانتو في العينة المسمى مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة. لذلك ، تعتبر هذه البكتيريا نشطة في التمثيل الغذائي وتستحق مزيدا من الدراسة. لذلك أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إشراك التحكم المناسب في تحليل CYP.

مما قد يطرح تأثير الخلفية ، فإن التلوث في وميض الشعر ويضمن ظهور البكتيريا ووفرة البكتيريا أو اختفائها ليست قطعة أثرية من الكتلة نفسها. باتباع هذا الإجراء أو منهجيات مثل التهجين الفلوري في الموقع يمكن استخدامه وتنفيذه من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. في هذه الحالة سوف تعتني بتوطين وترتيب البكتيريا داخل أمعاء الحشرة.