Name: حقن مكروي الجرح الفحص و في الجسم الحي توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في ذبابة الفاكهة الأجنة. (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: تعلم تصوير استجابة الجرح الجلدي في أجنة ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر المقطعي الضوئي. تُظهر هذه الطريقة تنشيط الجينات في الخلايا المحيطة بموقع الإصابة مباشرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تطوير هذا البروتوكول بالتعاون مع أعضاء السابقة للمختبر مغينس، كيم A. الصولجان وجوزيف جيم بيرسون. نشكر الجهود المتواصلة من قبل المركز الأسهم ذبابة الفاكهة بلومنجتون لعملهم لتنظيم وتوزيع أسهم القيمة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM077197 وK12 GM68524) وعائلة هربرت شتيرن. معتمد حاليا من قبل MTJ غرانت عدد 5G12RR003060-26 من المركز الوطني للبحوث الموارد والمنح عدد 8G12MD7603-27 من المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني في الأقلية الصحة والصحة التفاوت أو المعاهد الوطنية للصحة.

بروتوكول الجرح الجنينية ذبابة الفاكهة يمكن تلخيصها في خمس خطوات: (1) جمع الأجنة، (2) إعداد الأجنة (3) إصابة الأجنة، (4) حقن مكروي الأجنة، و (5) تثبيت الأجنة. 1. الجنين كوكتيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الذباب الكبار، بعد 2-3 أيام eclosing، إضافة 50 إناث و 25 ذكور إلى قفص جمع الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عصير التفاح الطازج بالإضافة إلى لوحة أجار الخميرة كل صباح لمدة 3 أيام. ملاحظات: لجمع الجنين الأمثل، ودورة الذباب على جدول زمني يومي 12 ساعة في حاضنة 25 ° C (05:00 أضواء &quot;ON&quot; و 17:00 أضواء &quot;OFF&quot;)؛ الذباب الإناث الاستجابة للتغيرات في دورة الضوء و ستودع كميات أكبر من البيض خلال التحول من أضواء &quot;ON&quot; إلى أضواء &quot;OFF&quot; 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في فترة ما بعد الظهر من يوم 3، ووضع عصير التفاح الطازج بالإضافة إلى الخميرة وحة آغار على القفص وجمع الأجنة لمدة 2 ساعة. وضع لوحة جديدة على الخميرة القفص وحفظ2 لوحة جمع ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين لوحة لجمع 14 ساعة إضافية عند 25 درجة مئوية إلى سن الأجنة. ملاحظات: يمكن أن يعاير التئام الجروح في أي مرحلة خلال تطوير ذبابة الفاكهة، وصحفيين الناجم عن الجرح النسخي وصفها في هذه الورقة لها النشاط الأمثل بين المراحل 15-16 ديسمبر. في أواخر المرحلة 17، والجنين هو قديم جدا لاختراق بسهولة بشرة الناضجة وتفعيل كفاءة صحفيين الجرح أو الجرح الناجم عن الكشف عن النسخ. لإتاحة الوقت لجمع وجرح الوقت أن يحدث خلال ساعات الذروة المختبر، ونحن نتابع جدولا زمنيا لجمع الأجنة لمدة 2 ساعة (16:00 حتي 18:00)، تبادل لوحة جمع مع لوحة جديدة في الساعة 18:00، والعمر لوحة جمع عند 25 درجة مئوية لمدة 14 ساعة (بين عشية وضحاها)، والجرح الأجنة في الساعة 08:00 (اليوم التالي). </li></ol> 2. إعداد الجنين ملاحظات: يتضمن هذا البروتوكول استخدام العديد من الأدوات والأشياء التي هي حادة أو مصنوعة من زمعشوقة. التعامل مع جميع الأدوات الحادة والأجسام الزجاج مع الحرص على تجنب الإصابة الشخصية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة الأجنة من لوحات مجموعة مع الفرشاة وذلك بإضافة 2-3 مل من الماء لوحة ودوامات. نقل المياه والأجنة من لوحة لشبكة النايلون وأنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4-5 مل من المبيض إلى غطاء من البلاستيك بيتري لوحة طبق ونقع في تغطية شبكة نهاية الأنبوب الذي يحتوي على جمع الأجنة في التبييض لمدة 2 دقيقة؛ الذي يزيل قشر البيض الخارجي للجنين. تدوير يدويا أنبوب جمع بضع مرات لمنع الأجنة من التثاقل في التبييض. شطف الأجنة مع 10x المياه وتجفيف شبكة تغطية جمع الأنبوب الذي يحتوي على أجنة dechorionated على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة تشريح لنقل الأجنة ~ 50 من النايلون شبكة لوحة آغار. نضيف الأخضر تلوين الطعام على لوحة أجار لإضافة التباين والمساعدات في محاذاة الجنين. تحت المجهر تشريح، وجعل اثنين من صفوف متوازية من 25 ~ الأجنة، محاذاة امبريالسراج على الشريحة بحيث أنها سوف تكون في زوايا الحق في ثقب الإبرة على جهاز microinjection. ترك القليل من الفضاء (حوالي 1 طول الجنين) بين الأجنة لأغراض تبادل الغازات. يجب أن تكون صفوف متوازية اثنين حوالي 5 ملم وبصرف النظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة مع ضعف العصا الشريط على رأس الأجنة الانحياز والضغط بعناية الشريحة لنقل الأجنة من لوحة خضراء إلى الشريحة. ثم الهواء الجاف الأجنة ~ 25 دقيقة لتخفيف الضغط الداخلي على الجنين ومنع حدوث انفجار عند اصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 2-3 قطرات من مزيج النفط الهالوكربون على الأجنة لمنع مزيد من الجفاف. </li></ol> 3. إصابة الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة الجنين في مرحلة المجهر الحقن. العثور على الأجنة في مجال الرؤية والممارسة تتحرك مرحلة مجهر مقلوب. ملاحظات: قبل أن تبدأ العمل مع الإبرة، والتركيز على الطائرة منتصف الجنين على طول محور ظهري بطني. للسماح للجرح الفعال للالأجنة الانحياز، تبدأ اصابة الصف أقرب إلى جهاز الإبرة. نقل المرحلة لتحقيق أعلى صف من الأجنة الانحياز في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية وتأمين إبرة سحبت في حامل الإبرة. استخدام مياداة مجهرية لتحريك الإبرة إلى أسفل نحو الشريحة. محاذاة الإبرة مع الجنين، في نفس المستوى البؤري. مرة واحدة على الإبرة في التركيز مع الجنين، لا تتحرك الإبرة مع مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة ثقب الجنين من خلال وعبر، ثم الانتقال إلى الجنين القادم في الصف. عندما تنتهي من ذلك اصابة الصف الأول، استخدم مياداة مجهرية لتحريك الإبرة تماما وحتى بعيدا من مرحلة قبل الانتقال الشريحة؛ تدوير يدويا الشريحة 180 درجة والجرح الصف الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الأجنة تحت الهالوكربون النفط في درجة حرارة الغرفة والمضي قدما في تثبيت الجنين إذا به الموقع التهجين أو تلوين الأجسام المضادة في (راجع الخطوة الإجرائية 5). بدلا من ذلك، تخزين الأجنة لمدة 4-6 ساعةتحت الهالوكربون النفط والمضي قدما الجرح النسخي التصور مراسل الفلورسنت (ممثل النتائج). ملاحظات: للحصول على تصور لمراسل الفلورسنت، ونحن تخدير الأجنة باستخدام 50٪ 1-فينوكسي-2-بروبانول 13. تتم إزالة الأجنة من النفط الهالوكربون ووضعها على شريحة جديدة. نضع الخرز الزجاجي حول الأجنة، إضافة بضع قطرات من مخدر، ووضع زلة تغطية على الأجنة. </li></ol> 4. الجنين حقن مكروي ملاحظات: لم يتم الآلي وجهاز microinjection التي نستخدمها في البروتوكول لتسليم حجم محددة خلال الفحص. نضيف صبغة إلى حل لتصور حقن مكروي ومحاولة تطبيع حجم تسليمها. إذا تم حقن الكثير الحل في الجنين، والغشاء المحي تنفجر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الإبرة من الخلف مع 1 ميكرولتر من المحلول الكيميائي بالإضافة إلى صبغ (على سبيل المثال 0.6 MH 2 O 2). تسمح الشعريةعمل لرسم الحل الكيميائية إلى رأس الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكسر إبرة، ضع الغطاء زلة في زاوية على شريحة ومعطف حافة مع مزيج النفط الهالوكربون. إحضار إبرة شنت في التركيز مع حافة الغطاء زلة الزاوية وبلطف نقل زلة تغطية حافة عبر غيض من الإبرة حتى كسر. الضغط على جهاز microinjection وتحقق من أن الحل الكيميائية بالإضافة إلى صبغ يتدفق من الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة التي تحتوي على أجنة الانحياز على المسرح المجهر. المضي قدما في التركيز على الجنين والإبرة في نفس الطائرة. ثقب في وقت واحد والحل microinject الكيميائية بالإضافة إلى صبغ في كل الجنين. ملاحظات: الإبر انسداد تحدث بشكل متكرر؛ كسر إبرة جديدة لتجنب حقن مكروي غير مكتملة. لا الجرح وهناك معلومات إبرة حادة كما نظيفة باعتبارها طرف الإبرة الزاوية. ضبط ساترة لغير زاوية 90 درجة خلال الكسر هو الأمثل لإنتاج طرف الإبرة الزاوية. </li></ol> 5. الفورمالديهايد فايxation ويلاحظ: إن المواد الكيميائية المستخدمة في هذا التثبيت ذبابة الفاكهة الضارة. استخدام معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة) عند التعامل مع المواد الكيميائية. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية الفردية للتخلص من المواد الكيميائية الخاضعة للتنظيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جرح، انتظر 15، 30، 60، دقائق أو أكثر لتفعيل النسخي من الجينات التي يسببها الجرح تحدث. لإزالة الأجنة من حقن الشرائح، واستنزاف بعناية مزيج النفط الهالوكربون من الشرائح، تتكئ الشريحة ضد رف وصمة عار النهاية مع Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لشطف هيبتان على الشريحة وغسل السائل شطف إلى طبق بتري الزجاج. سوف هيبتان حل الشريط وإطلاق سراح الأجنة. تواصل شطف حتى يتم إزالة جميع الأجنة من الشريحة. انتقل إلى الشريحة التالية، حتى يتم إزالة جميع الأجنة من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل هيبتان بالإضافة إلى حل الجنين من الطبق الزجاجي إلى الخيال العلمي 20 ملntillation القارورة. هز القارورة لمدة 2-3 دقيقة، وإزالة هيبتان وإضافة 5 مل من هيبتان الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من الطازجة، والحل تثبيت (انظر قائمة الكواشف لصفة). قبعة القارورة ونعلق على منصة شاكر المداري. هز قارورة تحتوي على أجنة لمدة 25 دقيقة في 220-230 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهز، والسماح للفقاعات في واجهة البوب. تماما إزالة، المرحلة المائية أسفل مع ماصة، وتجنب سحب ما يصل الأجنة. تتكون الطبقة السفلية من الحل التثبيت وينبغي التخلص منها بشكل سليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من الميثانول، وكأب القارورة ويهز بقوة باليد لمدة 20-30 ثانية، دوامة ووضعه على مقاعد البدلاء. سوف الأجنة الجرحى البقاء في البيني ولن تنزل الى القاع. ملاحظات: بعد التثبيت سوف تنفجر الغشاء المحي من الجنين المعافين عادة خلال الخطوة الجفاف مع الميثانول. ومع ذلك، هو كسر الغشاء المحي في جنين الجرحى بالفعل وسوف خطوة الجفاف تقم بإزالة MEMB المحيRANE. مطلوب اليد devitellinzation لاستكمال بروتوكول التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طبقة هيبتان أعلى ثم قم بإضافة 5 مل من الميثانول النقي. هز القارورة ويجب أن الأجنة تغرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الميثانول بالإضافة إلى حل الجنين مع ماصة نقل الزجاج وجمع في أنبوب جمع شبكة من النايلون في طبق زجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الميثانول وشطف الأجنة مع الحل برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة من شبكة من النايلون لوحة عصير التفاح. نشر الأجنة على طول سطح اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى شريحة زجاجية مزدوجة العصا الشريط. تغطية الأجنة مع برنامج تلفزيوني 1X. ملاحظات: الأجنة تميل إلى أجمة بسبب الغشاء المحي. باستخدام عصير التفاح مكان يسمح لفصل سريع للأجنة تجمعت. يجب إزالة الأجنة من لوحة ونقلها إلى شريحة زجاجية العصا الشريط مزدوجة لأن الأجنة تغوص لوحة آغار عندما يتم تطبيق قوة لإزالة الجنين منالمحي الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع بعناية الأجنة مع إبرة تشريح ل&quot;البوب&quot; الغشاء المحي. الجنين يجب أن تغرق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لنقل برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى الأجنة إلى أنبوب 1.5 مل. شطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني 1X وتخزينها في 4 درجات مئوية. انتقل إلى يذوى أجنة باستخدام الإيثانول: سلسلة برنامج تلفزيوني وتواصل مع الموقع التهجين أو immunolocalization البروتوكول في 14. </li></ol>

<ol><li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li>
<li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li>
<li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li>
<li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li>
<li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li>
<li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duox%2C+Flotillin-2%2C+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12%3A12+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li>
<li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li>
<li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846(2004).</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Drosophila+transgenic+reporters%3A+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li>
<li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773(2013).</li>
<li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li>
<li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li>
</ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

استجابة فورية لالنسخي التنظيمية العظة الخارجية يسمح الخلايا لتنسيق الاستجابة للمحفزات محلية خارج الخلية، والتي يمكن أن تشمل الإجهاد، والضرر، أو العدوى. سيطرة غير السليم للاستجابة محلية يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الخلايا المجاورة، فضلا عن هدر الموارد لإصلاح الضرر. يوفر الجنين ذبابة الفاكهة نظام ممتاز لإجراء تجارب التئام الجروح الأساسية في الحفاظ على لسهلة وغير مكلفة والنموذج الحي. إمكانية التعاون بين البحوث في الكائنات نموذج آخر وذبابة الفاكهة يوفر فرصة فريدة لاستكشاف العديد من الأسئلة البيولوجية. تقنية إضافية للصحفيين الجرح هو مزيج من الخلفيات الوراثية متحولة، وتوفير وسيلة فعالة لاختبار الجينات مساهمة جديدة لتفعيل المسار استجابة البشرة الجرح. لدينا البشرة الناجم عن الجرح صحفيين النسخي AVailable على كل من الثانية 2 و 3 الكروموزومات الثالثة 5. في هذه الدراسة التي نستخدمها UAS ونظم GAL4 من 16 من overexpression. للدراسات مع الأليلات الطافرة قاتلة نحدد الخلفية الجينية باستخدام كروموسوم موازن الفلورسنت، على سبيل المثال Kruppel-GFP 17. قمنا بتحليل توطين مراسل الجرح في عدة خلفيات وراثية (TABLE1). وهناك تعديل محتمل للتقنية هو الجمع بين حقن مكروي وجرح. حقن مكروي يمكن استخدامها لتقديم حل الكيميائية إلى الجنين. وقد تم اختبار العديد من المركبات الكيميائية وعثر لتنظيم نشاط للصحفيين البشرة الجرح 9. هذا الأسلوب من جرح وحقن مكروي في وقت واحد يمكن أن يكون مفيدا لزيادة عدد الخلايا في الجنين ذبابة الفاكهة التي تستجيب إشارة الجرح، ويمكن استخدامها مباشرة لرصد التغيرات في التعبير الجيني بعد اصابة 18. وسوف تطبيقها في المستقبل من تقنية حقن مكروي يكون لاختبار المواد الكيميائية الرواية لتنظيم استجابة البشرة الجرح. ذبابة الفاكهة كنظام نموذج للدراسات الجينية يقدم مجموعة واسعة من بروتوكولات بسيط لمعالجة المسائل المعقدة بكفاءة. التقارير الأخيرة حول جدوى تقنيات ذبابة الفاكهة يسلط الضوء على استخدام الهجرة كرية دموية 19 وإصابة 20 دبور الطفيلية كوسيلة لتوسيع تأثير مجتمع البحوث ذبابة الفاكهة. بالإضافة إلى دراسات إصلاح الجرح، ويوفر ذبابة الفاكهة نموذجا الكلاسيكية للتجديد مع نظام القرص تخيلي 21،22. التقدم جنبا إلى جنب في الدراسات القرص تجديد تخيلي وثقب / حقن مكروي جرح يوفر نظام ممتاز لاكتشاف مكونات حفظها جيدا من إصلاح الأنسجة.

التلاعب في الأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام تقنية حقن مكروي هو مقايسة راسخة 1. أهمية أسلوب مراسل استجابة البشرة الجرح هو الجمع بين بروتوكول للثقب / حقن مكروي مع صحفيين الفلورسنت وتصور استجابة في الجسم الحي لإصابات البشرة في أجنة ذبابة الفاكهة. الهدف من هذا الأسلوب هو تمكين مجموعة أوسع من العلماء لاستخدام ذبابة الفاكهة كأداة للتحقيق في العمليات التي تنظم استجابة النسخي لإصابات البشرة ثقب. البشرة احدة الطبقات في ذبابة الفاكهة يوفر نظام بسيط لدراسة استجابة البشرة الجرح بعد إصابة ثقب 2. الجنين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي قوية لتشريح وراثيا مراحل إصلاح الجرح، بما في ذلك الاستجابة الجرح، والالتهابات، وعودة التظهرن 3. هذا هو في جزء منه لأن العديد أو معظم لاقحي المسوخ البقاء على قيد الحياة حتى نهاية embryogenesهو وتطوير الحواجز البشرة حتى عندما يذهب الزخرفة التنموية منحرف عميقا. توصيف سابق من حفظها جيدا عامل النسخ رئيس محبب (GRH)، حدد أن الجينات المستهدفة GRH دوبا كربوكسيل (DDC) وهيدروكسيلاز التيروزين (التنوير القائل) يتم تنشيط transcriptionally حول مواقع الإصابة 4. ذبابة الفاكهة باعتباره النموذج الحي للاستجابة الجرح يوفر خط التكميلية التحقيق للمضي قدما في دراسات الثدييات التئام الجروح 5. وقد حددت الدراسات اللاحقة ذبابة الفاكهة جينات إضافية الناجم عن الجرح ووضع &quot;أدوات&quot; للعديد من الصحفيين الجرح الفلورسنت لرصد المجراة البشرة استجابة لتنظيف الجرح جرح 6. وقد ركزت التقارير الأخيرة بشأن تنظيم شفاء الجرح ذبابة الفاكهة على النمط الظاهري إغلاق الجرح، مما يسمح باكتشاف العديد من مسارات تنظيم الهجرة الخلية 7،8. مع تحليلالجرح صحفيين الفلورسنت، وقد حددت الدراسات لدينا مجموعة جديدة من الجينات المطلوبة للتعبير المترجمة من البشرة الجرح محرض الجينات 9. واحدة من مزايا أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج تقدم المزيد من التبصر في آلية لكيفية transduced إشارات من موقع الإصابة إلى الخلايا المجاورة. ومع ذلك، واحدة من عيوب أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج لا تصل مباشرة إلى الظواهر في التئام الجروح أو إصلاح. وتوسيع نطاق الاستفادة من بروتوكول الجرح ثقب نظيفة في شاشات الوراثية والكيميائية سماح المنظمين جديدة للاستجابة النسخي إلى البشرة مما أسفر عن إصابة الكشف عن هويته، وتعزيز التئام الجروح ترجمة الاكتشافات في نماذج الثدييات من العلاجات الاصابة.

<table><tbody><tr><td>خميرة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>عصير تفاح</td><td>أجار عام</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>مبيض</td><td>زيت</td> هالوكربون عام <td></td><td></td></tr><tr><td>، 700 واط</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>زيت هالوكربون ، 27 واط</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- الفينوكسي -2-البروبانول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>بيروكسيد الهيدروجين</td><td>فيشر Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>ميثيل بيتا سيكلودكسترين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>تولويدين الأزرق</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالديهايد ، 16٪</td> <td>Polysciences، Inc</td><td>18814-20</td><td>مادة كيميائية</td></tr><tr><td>سامة هيبتان</td><td>فيشر Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td> الكيميائي <td>السام فيشر العلمي</td><td>A412-1</td><td>مادة كيميائية سامة</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>فيشر Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 م EGTA</td><td>فيشر Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase الحرة H2O</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة حاضنة</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>قفص ذبابة</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب جمع الأجنة</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري بلاستيكي</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>شريط مزدوج العصا</td><td>فرشاة</td> رسم عامة <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>إبرة تشريح</td><td>فيشر Scientific</td><td>08-965A</td><td>غطاء زجاجي للجسم الحاد</td></tr><tr><td>زلة</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td> شريحة مجهر <td>جسم حاد</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td> مجهر <td>تشريح جسم حاد</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>إبرة شعرية</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>جسم</td></tr> <tr>حاد<td>مجتذب إبرة</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>حامل إبرة الحقن المجهري</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>المجهر</td> الدقيق <td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>المجهر المقلوب</td><td>كارل زايس</td><td>بريمو فيرت</td><td></td></tr><tr><td>الزجاج طبق بتري</td><td>فيشر العلمي</td><td>08-747A</td><td>زجاج جسم حاد</td></tr><tr><td>ماصة باستور</td><td>فيشر Scientific</td><td>22-063-172</td><td></td></tr><tr><td>لمبة نقل</td> الأشياء الحادة <td>فيشر Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>قارورة تلألؤ</td><td>فيشر Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>شاكر مداري</td> للجسم <td>الحاد فيشر Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب 1.5 مل</td><td>فيشر Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr> محلول تثبيت <tr><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td><td>متحد البؤر بالليزر</td></tr> <tr><td></td><td>(5 مل)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>16٪ فورمالديهايد</td><td>2.5 مل</td><td></td><td>مادة كيميائية سامة</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5 مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>0.5 مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase خال من H2O</td><td>1.5 مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مزيج زيت الهالوكربون</td> <td>(10 مل)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>زيت هالوكربون ، 700 واط</td><td>5 مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>زيت هالوكربون ، 27 واط</td><td>5 مل</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

الجنين ذبابة الفاكهة يطور طبقة البشرة قوية يخدم على حد سواء لحماية الخلايا الداخلية من البيئة الخارجية القاسية وكذلك للحفاظ على التوازن الخلوية. إصابة ثقب الإبر مع الزجاج يوفر طريقة مباشرة لتحريك البشرة الجرح الاستجابة السريعة التي ينشط الجرح صحفيين النسخي، والتي يمكن أن تصور من قبل إشارة مراسل المترجمة في الأجنة الحية أو اليرقات. كما يوفر ثقب أو الليزر إصابة الإشارات التي تشجع على توظيف hemocytes إلى موقع الجرح. من المستغرب، شديدة (من خلال وعبر) إصابة الأجنة ثقب في مرحلة متأخرة إلا نادرا يعطل التطور الجنيني الطبيعي، وأكثر من 90٪ من هذه الأجنة الجرحى البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة البلوغ عندما يتم حقن الأجنة في المتوسط ​​للنفط التي تقلل من تسرب الفوري لالدملمف من مواقع ثقب . الإجراء الجرح لا تتطلب المجهرية للأجنة ذبابة الفاكهة، بما في ذلك المواءمة دليل للأجنة على آغلوحات ع ونقل الأجنة إلى محاذاة المجهر الشرائح. يوفر استجابة ذبابة الفاكهة البشرة الجرح فحص نظام سريع لاختبار متطلبات الوراثية من مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية التي تعزز التئام الجروح، وكذلك وسيلة للكشف عن المركبات الكيميائية المحتملة التي تعزز التئام الجروح. دورة حياة قصيرة وسهلة زراعة الروتينية جعل ذبابة الفاكهة نموذج كائن قوية. يبدو ذبابة الفاكهة نظيفة التئام الجروح لتنسيق استجابة التجدد البشرة، مع الاستجابة المناعية الفطرية، في الطرق التي لا تزال قيد التحقيق، والذي يوفر نظام ممتاز للعثور على الحفظ التنظيمية آليات مشتركة لذبابة الفاكهة والثدييات البشرة جرح.

للحصول على النتائج المبينة في هذا الأسلوب، وتنصهر في إطار القراءة المفتوح للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) إلى مروج / الجرح الناجم عن تسلسل محسن من دوبا كربوكسيل (DDC) وتنصهر DsRed لتسلسل الجرح محسن من هيدروكسيلاز التيروزين ( التنوير القائل) 4،6. في ذبابة الفاكهة الأجنة الحية، ونضوج البروتين الفلوري مراسل الجرح هو الأمثل 4-6 ساعة بعد اصابة، والذي يسمح الوقت لتراكم البروتين كافية لتصور، وكذلك الوقت المناسب لبروتين فلوري للأكسدة للدولة الفلورسنت 15. لمراقبة توطين مراسل المجهر الفلورسنت مجمع كافية. لمراقبة التكبير أعلى من توطين مراسل المجهر متحد البؤر هو الأمثل لتوليد إسقاط الحد الأقصى من المقاطع البصرية متعددة (الشكل 1). متحد البؤر التصوير في الجسم الحي من أجنة ذبابة الفاكهة تعقيدا هو راالتموجات PID الجنين. . وجهة نظر كاملة من الجنين يمكن الحصول عليها مع 20X الهدف وجهة نظر عن قرب من موقع الجرح ويمكن الحصول عليها مع 40X الهدف. وجهة نظر العلوي من البشرة مراسل الجرح التوطين ولا يمكن تصوير مع 10 أقسام متتالية البصرية 1μm. وجهة نظر الأطراف من البشرة مراسل الجرح التوطين ولا يمكن تصوير مع 40 المتتالية 1 ميكرومتر المقاطع البصرية. باستخدام أساليب معبر الجينية القياسية، فمن الممكن الجمع بين صحفيين الجرح مع الطفرات الجينية. أحد الأمثلة الواردة في هذه الورقة هو Flotillin-2 (فلو-2)، وذلك لأن كسب من بين وظيفة (ولدت من overexpression مع التعبير في كل مكان في جميع الخلايا) المسوخ الخسارة من وظيفة (أليل فارغة ولدت مع P-عنصر الإدراج) و فلو 2 تدليل على الجين المنتج فلو-2 غير الضرورية والكافية لمنع توطين DDC-GFP الجرح صحفيين 9 (أرقام 2A و 2B). باستخدام ميلبروتوكول croinjection، فمن الممكن لاختبار ما إذا كان إدخال المحاليل الكيميائية superactivates أو يحول دون توطين صحفيين الجرح. تم الأجنة جرح كيميائيا الجرحى في وقت واحد وحقنه مع نسبة 1٪ 01:04 طولويدين صبغة زرقاء والمركبات solubilized. طولويدين صبغة زرقاء يسمح لتأكيد البصرية من المركبات solubilized يجري حقنها في تجويف الجسم. أصيب الأجنة التحكم بإبرة تحتوي على كسر 1:04 نسبة 1٪ طولويدين صبغة زرقاء والمذاب دون الكيميائية. مثالين الواردة في هذه الورقة هي بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) وميثيل β-cyclodextrin (MβCD)، لأن كلا من المحاليل الكيميائية كافية لتنشيط عالميا في توطين DDC-GFP الجرح صحفيين 9 (أرقام 2C و 2D) . تم تخفيفه بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في H 2 O إلى 0.6 م ميثيل β-cyclodextrin (MβCD) تم solubilized في 1 مM هيدروكسيد الصوديوم إلى 3 ملم. باستخدام بروتوكول الجنين التثبيت، فمن الممكن للكشف عن تفعيل النسخ من الجينات استجابة الجرح في مجال المترجمة، المحيطة موقع الجرح. أحد الأمثلة الواردة في هذه الورقة هو الموقع التهجين تحقيقات الحمض النووي الريبي لفي الكشف عن DDC والنصوص التنوير القائل 4،6،9 (أرقام 3A 3B و). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. DDC-GFP والتنوير القائل-DsRed الجرح مراسل التعريب. Brightfield والصور الفلورسنت في اصابة الأجنة البرية من نوع (أ) عرض للأعلى DDC-GFP مراسل الجرح. (B) عرض للأعلى التنوير القائل-DsRed الجرح المراسل. تم جمع كافة الصور على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع 20X الهدف. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحة البياناتو بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. توطين مراسل DDC-GFP الجرح في الخلفيات متحولة الوراثية والكيميائية microinjected الأجنة. Brightfield والصور الفلورسنت من الجرحى Flotillin-2 (فلو-2) الأجنة متحولة. (A) لتخفيف من وظيفة فلو-2} {KG00210 المسوخ، التوسع في النشاط الصحفي في جميع خلايا البشرة. (B) كسب من بين وظيفة فلو 2 (المدرع-GAL4، UAS-Flo2) المسوخ، وتثبيط النشاط مراسل في جميع خلايا البشرة. (C) بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2 ) حقن مكروي الحل، وتوسيع مندوبORTER النشاط في جميع خلايا البشرة. (D) ميثيل β-cyclodextrin (MβCD) حقن مكروي الحل، والتوسع في النشاط الصحفي في جميع خلايا البشرة. تم جمع كافة الصور على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع 20X الهدف. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحات البيانات بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> الرقم 3. الكشف عن استجابة الجرح نسخ الرنا الجينات. الصور نيون من الموقع التهجين والكشف عن الحمض النووي الريبي في الأجنة في الجرحى النوع البري. DDC (A) والتنوير القائل (B) نسخ الحمض النووي الريبي تتجمع حول موقع الجرح. وكانت كل الصور جامعيتيد على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع الهدف 20X. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحات البيانات بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الجدول 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> الجدول 1. ملخص للصحفيين ردا البشرة الجرح. الإدراج من صحفيين ردا الجرح الأربعة (DDC، التنوير القائل، ام اس ان، KKV) متوفرة على كل من الكروموسومات الثانية والثالثة. كل من صحفيين ردا الجرح تنشيط الجين مضان (GFP أو DsRed) في عدد محدود من خلايا البشرة المحيطة بموقع الإصابة ثقب في البرية من نوع الخلفية (مثل النمط الظاهري &quot;المحلي&quot;). DDC وام اس ان الجرح للصحفيين ردا تتطلب GRH ل تفعيل fluorescenم الجين بعد إصابة ثقب (على سبيل المثال &quot;لا شيء&quot; النمط الظاهري). كل من صحفيين الجرح تتطلب فلو-2 لتوطين الجين مضان بعد إصابة ثقب (مثل النمط الظاهري &quot;العالمية&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

البشرة الجنينية من الأجنة مرحلة متأخرة جدا ذبابة الفاكهة يوفر نظام في الجسم الحي لتحليل استجابة ثقب الجرح سريعا ويمكن دمجها مع التلاعب الجيني أو علاجات حقن مكروي الكيميائية للمضي قدما دراسات في التئام الجروح للترجمة في نماذج الثدييات.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو التصوير الحي لبروتين مؤشر لاستجابة جروح البشرة في جنين ذبابة الفاكهة (drosophila). يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال جمع المرحلة النمائية التي يمكن فيها الكشف عن نشاط المؤشر بشكل ثابت. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ثقب الجنين باستخدام إبرة زجاجية وجهاز حقن مجهري.تتمثل الخطوة الثالثة في تخدير الجنين لرؤية المراسل. والخطوة النهائية هي التحقق من تموضع المراسل عن طريق الكشف عن نمط تعبير مجسات RNA. وفي النهاية، يمكن أن تُظهر النتائج من خلال المجهر البؤري التزامني التنشيط النوعي لمراسل استجابة جروح البشرة في الخلايا المحيطة بموقع إصابة الوخز فقط.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية التي تعتمد على مراقبة إغلاق الجروح في قدرتنا على رؤية التعبير الجيني المحفز بجروح الثقب في الأجنة الحية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إصلاح الأنسجة، مثل كيفية قيام الخلايا المحيطة بالإصابة بتنظيم الاستجابة الفورية للجرح لتعزيز عملية الإصلاح. وتمتد آثار هذه التقنية إلى علاج أو تشخيص تجديد الأنسجة لأن تنظيم الاستجابة للجروح يمثل الخطوة الأولية.يمكن إجراء تحليل التئام الجروح في أي مرحلة من مراحل النمو. ومع ذلك، بحلول المرحلة 17، تصبح القشيرة ناضجة للغاية، وبالتالي لن يتم تفعيل مؤشرات الجروح المعروفة.للتوضيح، سيتم جرح المرحلة 15 إلى 16 لحصاد الأجنة. يتم جمع ذباب بالغ يتراوح عمره بين يومين إلى ثلاثة أيام، بواقع 50 أنثى و25 ذكراً. ثم تُنقل هذه الحشرات إلى قفص تجميع الأجنة يحتوي على طبق طازج من عصير التفاح والأجار وكمية صغيرة من عجينة الخميرة.يُحفظ القفص في درجة حرارة 25 °C كل صباح خلال الأيام الثلاثة التالية. استبدل الطبق بآخر جديد. وفي بعد ظهر اليوم الثالث، اترك البيض يتراكم على طبق جديد لمدة ساعتين.يُحفظ هذا الطبق لمدة 14 ساعة عند 25 درجة مئوية. ومن المفترض أن ينتج وضع البيض لمدة ساعتين حوالي 200 جنين في اليوم التالي. أضف بضعة مليلترات من الماء إلى الطبق وقم بتحريكه بلطف.بعد ذلك، وباستخدام فرشاة رسم، انقل الماء والأجنة من الطبق إلى سلة شبكية من النايلون موجودة في أنبوب تجميع. الآن، قم بإعداد حمام تبييض ضحل وانقع الأجنة فيه لمدة دقيقتين. تزيل هذه الخطوة الـ CORs، أي البيض.قم بتدوير الحمام بلطف لبضع مرات لمنع تكتل الأجنة. بعد دقيقتين، اشطف الأجنة بماء جارٍ وفي طبق بتري لمدة خمس ثوانٍ لكل منهما. ثم انقل سلة الأجنة إلى منشفة ورقية لتجفيف الأجنة.بعد ذلك، وباستخدام إبرة تشريح، انقل حوالي 50 جنينًا من الشبكة إلى طبق أغار مُحضّر بصبغة طعام خضراء؛ حيث تُستخدم هذه الصبغة لزيادة رؤية بيوض الركبة. وتحت مجهر التشريح، رتّب الأجنة في صفين متوازيين تفصل بينهما مسافة خمسة مليمترات تقريبًا.باعد بين الصفوف بمسافة تعادل عرض الجنين للسماح بتبادل الغازات. بعد ذلك، اضغط بعناية شريحة مثبتة بشريط لاصق مزدوج الوجه فوق الأجنة بحيث تكون الصفوف متعامدة مع طول الشريحة. ولتقليل الضغط الداخلي، اترك الأجنة لتجف في الهواء.بهذه الطريقة، لن تنفجر الأجنة عند تعريضها للجرح. بعد مرور 25 دقيقة، يجب أن تكون الشريحة الأولى المُحضرة قد جفت. الآن، قم بتغطية الأجنة بنقطتين إلى ثلاث نقاط من زيت الهالوكربون لمنع المزيد من الجفاف، ثم ابدأ فوراً في جرح الأجنة الجافة.ضع شريحة الأجنة على منصة مجهر الحقن. ابحث عن الأجنة في مجال الرؤية وتدرب على تحريك منصة المجهر المقلوب. الآن، قم بضبط التركيز على المستوى المتوسط للجنين على طول المحور الظهري البطني وأحضر الجنين العلوي من الصف الأول المصطف إلى مجال الرؤية.بعد ذلك، ضع إبرة مسحوبة بعناية وثبتها في حامل الإبر. استخدم المجهر الدقيق لتحريك الإبرة للأسفل باتجاه الشريحة. قم بمحاذاة الإبرة مع الجنين في نفس المستوى البؤري.الآن، لا تقم بإجراء أي تعديلات إضافية على الميكرومانيبولاتور. والآن، حرك المنصة لثقب الجنين من الطرف إلى الطرف. بعد ذلك، انتقل إلى الجنين التالي في الصف.بعد جرح الصف الأول، حرك الإبرة للأعلى تماماً وبعيداً عن المسرح. ثم قم بتدوير الشريحة واستمر في ثقب الأجنة في الصف الثاني. وبمجرد جرح جميع الأجنة، يمكن تثبيتها فوراً لإجراء التهجين الموضعي أو التلوين بالأجسام المضادة.لفحص المراسلين الفلوريين، انتظر من أربع إلى ست ساعات وانقل الجنين إلى شريحة جديدة، وضع خرزات زجاجية حول الأجنة. ثم أضف بضع قطرات من 50% One phenoxy, two propanol، وهو مادة تخدير، وضع غطاء شريحة على الأجنة لإجراء الحقن المجهري. قم بتعبئة إبرة الحقن من الخلف بـ 1 µL من المحلول الكيميائي مضافاً إليه صبغة، مثل 0.6 M hydrogen peroxide.اترك الخاصية الشعرية تسحب المحلول الكيميائي إلى طرف الإبرة. بعد ذلك، اكسر طرف الإبرة مقابل حافة غطاء شريحة في خليط زيت الكربون الهالو. أولاً، اضبط تركيز الإبرة المثبتة مع حافة غطاء الشريحة المائل بزاوية تقل قليلاً عن 90 درجة.بعد ذلك، حرك حافة غطاء الشريحة بلطف فوق طرف الإبرة حتى تنكسر. ثم طبق الضغط على جهاز الحقن المجهري وتحقق من تدفق المحلول من الإبرة. إذا لم يتدفق، قم بكسر طرف الإبرة أكثر قليلاً.الآن، قم بتنفيذ نفس الإجراء المستخدم لثقب الأجنة فقط. وفي هذه المرة، قم بالحقن المجهري للمحلول بالتزامن مع عملية الثقب. ويفضل حقن 10 nanoliters.إذا تم حقن كمية كبيرة جداً من المحلول في الجنين، فإن غشاء Vitale سوف ينفجر؛ لذا يرجى إيلاء اهتمام دقيق للخطوات التالية أثناء اتباع إجراء التثبيت المذكور في البروتوكول النصي. استخدم ماصة زجاجية، وليس بلاستيكية، لشطف الهبتان فوق الشريحة، واستخدم الزجاج لتدوير الأجنة نحو مركز طبق بتري الزجاجي. لاحقاً، قم برج الأجنة في المثبت لمدة 25 دقيقة بسرعة تتراوح بين 220 إلى 230 RPM.بعد الرج، اترك الفقاعات الموجودة عند السطح الفاصل حتى تتلاشى قبل إزالة الطور المائي السفلي تماماً. كما يجب توخي الحذر لضمان عدم سحب الأجنة. بعد إضافة الميثانول، من المفترض أن تتجمع الأجنة المصابة عند السطح الفاصل لاحقاً؛ لذا قم بتوزيع الأجنة على سطح الطبق بهذا الشكل، ثم انقلها إلى شريحة زجاجية تحتوي على شريط لاصق مزدوج الوجه كما هو موضح.ثم ادفع الأجنة بعناية باستخدام إبرة التشريح لثقب غشاء Vitale والمتابعة في عملية التجفيف. تم تحويل ذباب النوع البري باستخدام مراسلين فلوريين مدمجين مع معززات DOPA decarboxylase أو tyrosine hydroxylase وإخضاعها للمقايسة الموصوفة. ومن خلال المجهر ذو الحقل المضيء، كان من الممكن رؤية موقع الجرح، بينما أتاح الإضاءة الفلورية رؤية نشاط مراسل DCD في موقع الجرح.أظهر مراسل تيروزين هيدروكسيلاز نتيجة مماثلة. وقد تم جمع كلتا الصورتين باستخدام مجهر Leica SP two confocal وبعدسة شيئية بقوة 20 x. نُفذ هذا الإجراء في طافرة flow two ذات فقدان الوظيفة.الخلفية، تم توسيع نشاط المراسل لإنزيم DOPA decarboxylase عبر الخلايا البشرية في طفرتي "كسب الوظيفة" اللتين تم إنتاجهما بتعبير شامل في جميع الخلايا. ولوحظ تثبيط للمراسل في جميع الخلايا البشرية. بعد ذلك، تم جرح الأجنة وحقنها في وقت واحد بمركب ذائب وصبغة udine الزرقاء، حيث أدى بيروكسيد الهيدروجين والماء إلى توسيع نشاط مراسل DOPA decarboxylase في الخلايا البشرية، كما فعل حقن methyl B cyclodextrin في هيدروكسيد الصوديوم باستخدام التهجين الموضعي داخل الخلايا.تم فحص التنشيط النسخي لجينات الاستجابة للجروح عن طريق قياس إنزيم DOPA decarboxylase الداخلي. ولوحظ أن التعبير عن RNA كان متمركزاً حول موقع الجرح، وبالطبع، وُجد أيضاً أن نسخ RNA الخاصة بإنزيم tyrosine hydroxylase تتراكم عند موقع الجرح. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون 60 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم عدم استهلاك وقت طويل في محاذاة الأجنة والمضي قدماً في الخطوات التالية من الإجراء.

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في...

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء الحقن المجهري الذي ينقل الكواشف إلى أجنة ذبابة الفاكهة الحية. يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لإدخال مركبات خارجية مثل الأحماض النووية والبروتينات خلال المراحل المبكرة من نمو الجنين. يوضح البروتوكول المميز كيفية إعداد وتنفيذ إجراء حقن أي كاشف قابل للذوبان - هنا ، بروتين فلوري لتجارب التصوير الحي.

الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة الحية: التسليم المبكر للكواشف إلى الجنين النامي

يرقات ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجا جذابا للتصوير الحية نظرا لبشرة شفافة وعلم الوراثة الخاصة بهم قوية. يصف هذا البروتوكول كيفية الاستفادة من جهاز PDMS طبقة واحدة، ودعا 'رقاقة اليرقة' للتصوير حية من العمليات الخلوية داخل الخلايا العصبية من 3 طور مرحلي الثالثة يرقات ذبابة الفاكهة.

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

البالغ C. ايليجانس الجلد هو نموذج قابل للتتبع لدراسات استجابات الجرح الظهاري ، بما في ذلك إغلاق الجرح وتكوين الندبات والمناعة الفطرية.

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في C. ايليجانس

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

نقدم هنا بروتوكولا لإصلاح الجرح العيش-التصوير والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها في عالية الدقة الزمانية في فيفو. هذا الأسلوب يستخدم الخوادر مرحلة التنمية المورفولوجية لتمكين الطويلة الأجل التصوير وتعقب السكان خلية معينة على مر الزمن ومتوافق مع الجينات بوساطة [رني] كفاءة المنظمة.

طويلة الأمد في فيفو تتبع ديناميات الخلايا التحريضية داخل الخوادر المورفولوجية

الزرع المستحث بالجرح هو استراتيجية إصلاح الأنسجة المحفوظة حيث تنمو الخلايا في الحجم بدلاً من الانقسام للتعويض عن فقدان الخلايا. هنا هو بروتوكول مفصل حول كيفية استخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لقياس ploidy وتنظيمها الجيني في إصلاح الجرح الظهارية.

نموذج دروسوفيليا لدراسة البوليسبليد الناجم عن الجروح

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

توضح هذه البروتوكولات كيفية توصيف تنظيم ووظيفة الإغلاق لوصلات القطع الصوفية المطوية في الظهارة الجنينية الضابطة والطفرة في ذبابة الفاكهة.

تجارب صبغ المناعة واختراق الصبغة لتعريف بروتينات الوصلة الحاجز ذات الطيات الأساسية في ظهارة جنين ذبابة الفاكهة

تعلم تصوير استجابة الجرح الجلدي في أجنة ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر المقطعي الضوئي. تُظهر هذه الطريقة تنشيط الجينات في الخلايا المحيطة بموقع الإصابة مباشرة.

حقن مكروي الجرح الفحص و

استكشف المزيد من الفيديوهات