حقن مكروي الجرح الفحص و في الجسم الحي توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في ذبابة الفاكهة الأجنة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور مراسل في الجسم الحي لاستجابة الجرح في البشرة في ذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك من خلال جمع مرحلة التطور أولا حيث يمكن اكتشاف نشاط المراسل باستمرار. الخطوة الثانية من الإجراء هي ثقب الجنين باستخدام إبرة زجاجية وجهاز حقن مجهري.

الخطوة الثالثة هي تخدير الجنين لتصور المراسل. تتمثل الخطوة الأخيرة في التحقق من صحة توطين المبلغ عن طريق اكتشاف نمط التعبير لمجسات الحمض النووي الريبي. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج التنشيط المحدد لمراسل استجابة الجرح في البشرة فقط في الخلايا المحيطة بموقع إصابة البزل من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية التي تتضمن النظر إلى إغلاق الجرح هي أنه يمكننا أن نرى في الأجنة الحية التعبير الجيني الذي ينتج عن جرح البزل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح الأنسجة ، مثل كيفية تنظيم الخلايا المحيطة بالإصابة للاستجابة الفورية للجرح لتعزيز الإصلاح. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج أو تشخيص تجديد الأنسجة لأن تنظيم استجابة الجرح هو الخطوة الأولى.

يمكن فحص التئام الجروح في أي مرحلة من مراحل التطور. ومع ذلك ، بحلول المرحلة 17 ، تكون البشرة ناضجة جدا. لن يتم تنشيط مراسلي الجروح المعروفين.

لذلك للتوضيح ، ستصاب المرحلة من 15 إلى 16 لحصاد الأجنة. اجمع الذباب البالغ البالغ من يومين إلى ثلاثة أيام ، 50 أنثى و 25 ذكرا. انقلها إلى قفص لجمع الأجنة مع طبق طازج من عصير التفاح والأجار وقطعة من معجون الخميرة.

ضع القفص عند 25 درجة مئوية كل صباح خلال الأيام الثلاثة القادمة. استبدل اللوحة بأخرى جديدة. بعد ظهر اليوم الثالث ، اترك البيض يتراكم على طبق طازج لمدة ساعتين.

قم بتخزين هذا الطبق لمدة 14 ساعة عند 25 درجة مئوية. يجب أن ينتج عن الاستلقاء لمدة ساعتين حوالي 200 جنين في اليوم التالي. أضف بضعة ملليلتر من الماء إلى الطبق ولفه برفق.

ثم باستخدام فرشاة الرسم ، انقل الماء والأجنة من اللوحة إلى سلة شبكية من النايلون في أنبوب تجميع. الآن اصنع حمام مبيض ضحل وانقع الأجنة فيه لمدة دقيقتين. هذه الخطوة تزيل CORs ، البيض.

بتدوير الحمام عدة مرات لمنع الأجنة من التكتل. بعد دقيقتين ، اشطف الأجنة بالماء المتدفق وشطف أطباق بتري لمدة خمس ثوان لكل منهما. ثم انقل سلة الأجنة إلى منشفة ورقية لتجفيف الأجنة.

بعد ذلك ، باستخدام إبرة تشريح ، انقل حوالي 50 جنينا من الشبكة إلى صفيحة أجار مصنوعة من صبغة طعام خضراء. الصبغة لزيادة رؤية بيض الركبة. تحت نطاق تشريح ، قم بعمل صفين متوازيين من الأجنة على بعد حوالي خمسة ملليمترات.

ضع الصفوف بعيدا عن بعضها البعض بعرض الجنين للسماح بتبادل الغازات. بعد ذلك ، اضغط بعناية على شريحة بشريط لاصق مزدوج على الأجنة بحيث تكون الصفوف متعامدة مع طول الشريحة. لتقليل ضغطها الداخلي ، اترك الأجنة تجف في الهواء.

بهذه الطريقة لن ينفجروا عندما يصابون. بعد 25 دقيقة ، يجب أن تجف الشريحة الأولى المحضرة. الآن ، قم بتغطية الأجنة بقطرتين إلى ثلاث قطرات من زيت الكربون الهالة لمنع المزيد من الجفاف والمضي قدما على الفور في جرح الأجنة الجافة.

ضع شريحة الجنين في مرحلة مجهر الحقن. ابحث عن الأجنة في مجال الرؤية وتدرب على تحريك مرحلة المجهر المقلوب. ركز الآن على المستوى الأوسط للجنين على طول المحور البطني الظهري وجلب الجنين العلوي للصف الأول المحاذي إلى مجال الرؤية.

بعد ذلك ، ضع بعناية وقم بتثبيت إبرة مسحوبة في حامل الإبرة. استخدم المعالج الصغير لتحريك الإبرة لأسفل إلى الشريحة. قم بمحاذاة الإبرة مع الجنين في نفس المستوى البؤري.

الآن ، لا تقم بضبط مناور الميكروم أكثر من ذلك. الآن حرك المرحلة لثقب الجنين من خلاله وعبره. ثم انتقل إلى الجنين التالي في الصف.

بعد جرح الصف الأول ، حرك الإبرة تماما لأعلى وبعيدا عن المسرح. ثم قم بتدوير الشريحة واستمر في ثقب الأجنة في الصف الثاني. بمجرد إصابة جميع الأجنة ، يمكن تثبيت الأجنة على الفور من أجل التهجين أو تلطيخ الأجسام المضادة.

لفحص المراسلين الفلوريين ، انتظروا من أربع إلى ست ساعات ونقلوا الجنين إلى جنين جديد على الشريحة الجديدة ، وضعي حبات زجاجية حول الأجنة. ثم أضف بضع قطرات من 50٪ فينوكسي واحد ، واثنين من البروبانول ، وهو مخدر ، ووضع غطاء على الأجنة للحقن الدقيقة. قم بتحميل إبرة الحقن من الخلف بميكرولتر واحد من المحلول الكيميائي بالإضافة إلى الصبغة ، مثل بيروكسيد الهيدروجين 0.6 مولار.

اسمح للعمل الشعري لسحب المحلول الكيميائي إلى طرف الإبرة. بعد ذلك ، اكسر طرف الإبرة على حافة زلة الغطاء في مزيج زيت الكربون الهالة. أولا ، قم بتركيز الإبرة المثبتة مع انزلاق حافة الغطاء الزاوي عند 90 درجة تماما.

بعد ذلك ، حرك حافة انزلاق الغطاء برفق عبر طرف الإبرة حتى تنكسر. ثم اضغط على جهاز الحقن المجهري وتأكد من تدفق المحلول من الإبرة. إذا لم تتدفق ، اكسر الإبرة أكثر قليلا.

الآن ، قم بإجراء نفس الإجراء المستخدم لثقب الأجنة فقط. هذه المرة ، يقوم الميكرو بحقن المحلول في وقت واحد مع الثقب. من الناحية المثالية ، قم بحقن 10 نانولترات.

إذا تم حقن الكثير من المحلول في الجنين ، فسوف ينفجر غشاء Vitale أثناء اتباع إجراء التثبيت في بروتوكول النص ، انتبه جيدا للخطوات التالية. استخدم ماصة زجاجية ، وليس بلاستيكية لشطف السباع فوق الشريحة واستخدم الزجاج لتحريك الأجنة في وسط طبق بتري الزجاجي. في وقت لاحق ، رج الأجنة في المثبت لمدة 25 دقيقة بسرعة 220 إلى 230 دورة في الدقيقة.

بعد الاهتزاز ، دع الفقاعات في الواجهة تنبثق قبل إزالة المرحلة المائية السفلية تماما. احرص أيضا على عدم سحب الأجنة. بعد إضافة الميثانول ، يجب أن تتجمع الأجنة المصابة في الواجهة لاحقا ، وتنشر الأجنة على طول سطح اللوحة مثل ذلك ، وتنقلها إلى شريحة زجاجية ذات شريط مزدوج اللصق مثل ذلك.

ثم ادفع الأجنة بحذر بإبرة التشريح لفرقعة غشاء Vitale والمضي قدما في الجفاف. تم تحويل الذباب من النوع البري مع مراسلي الفلورسنت الذين تم دمجهم في محسنات ديكاربوكسيلاز DOPA أو هيدروكسيلاز التيروزين وإخضاعها للفحص الموصوف. تحت الحقل الساطع ، كان من الممكن رؤية موقع الجرح أثناء إضاءة التألق ، كان من الممكن رؤية نشاط مراسل الجرح DCD.

أظهر مراسل هيدروكسيلاز التيروزين نتيجة مماثلة. تم جمع كلتا الصورتين على مجهر Leica SP ثنائي البؤر بهدف 20 ×. تم تنفيذ الإجراء في فقدان تدفق الوظيفة اثنين من متحول.

خلفية ، تم توسيع نشاط مراسل ديكاربوكسيلاز DOPA في جميع أنحاء خلايا البشرة في اكتساب تدفق الوظيفة اثنين من الطفرات التي تم إنشاؤها مع التعبير في كل مكان في جميع الخلايا. لوحظ تثبيط المراسل في جميع أنحاء خلايا البشرة. بعد ذلك ، تم إصابة الأجنة وحقنها في وقت واحد بمركب قابل للذوبان وبيروكسيد الهيدروجين بالصبغة الزرقاء أودين ونشاط مراسل دوبا ديكربوكسيلاز الموسع بالماء في خلايا البشرة ، كما فعل حقن ميثيل ب سيكلودكسترين في هيدروكسيد الصوديوم باستخدام تهجين داخل U.

التنشيط النسخي لجينات استجابة الجرح هو فحص DOPA decarboxylase الذاتي. شوهد تعبير الحمض النووي الريبي موضعيا حول موقع الجرح ، وبالطبع ، هيدروكسيلاز التيروزين ، تم العثور أيضا على نصوص الحمض النووي الريبي تتراكم في موقع الجرح. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 60 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم عدم قضاء الكثير من الوقت في محاذاة الأجنة والمضي قدما في الخطوات التالية في الإجراء.