بروتوكول الفحص على أساس خلية للتنبؤ النذير من الجنف مجهول السبب عن طريق الخلوي عازل الطيفي

الهدف العام من التجربة التالية هو التنبؤ بتشخيص الجنف مجهول السبب وفقا للمجموعة الوظيفية للمرضى عن طريق فحص استجابة PBM C لتنشيط GPCR R باستخدام التحليل الطيفي العازل الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة pbmc في وجود phyto hemagglutinin أو PHA لتوسيع عدد الخلايا. يكتمل توسيع الخلية في أنبوب ، يتم الحفاظ عليه في وضع مائل.

كخطوة ثانية ، يتم معالجة الخلايا باستخدام OSTEOPONTIN أو OPN ، مما يزيد أو يقلل من نشاط بروتين الجهاز الهضمي. اعتمادا على المرضى بعد العلاج ، يتم نقل تعليق الخلية إلى الصفيحة الدقيقة. بعد ذلك ، يتم تحفيز الخلايا باستخدام ناهضات GI أو GS GPCR لتحديد تغيرات المعاوقة الناتجة.

توفر النتائج استجابات حركية لجميع الآبار ثم يتم قياس الاستجابات المتكاملة بناء على تغيرات المعاوقة. الآثار المترتبة على هذه التقنية تتجاوز مجرد التشخيص. لذلك لأول مرة ، يمكننا الكشف في مرحلة مبكرة عن المرضى الذين تظهر عليهم الأعراض معرضين لخطر الإصابة بالجنف ، والآن نعرف من سيصاب بالجنف أو في أي مرحلة ، يمكننا توفير علاجات جديدة لعلاجهم.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعرض للأشعة السينية ، هي أن هذه التقنية تسمح بالتنبؤ بالجنف التقويمي مع عدم الحاجة إلى قياس كوفيد وعدم وجود مخاطر صحية. أحدث شيء, هذه التقنية الآن سيكون مساعد البحث لدينا نيتا فرانكو, ذوبان الجليد من aliquot المجمدة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة في حمام مائي 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة معقمة، انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 15 مل من الوسائط الكاملة وأجهزة الطرد المركزي.

تستنشق الخلايا المادة الطافية. ثم قم بتعليق حبيبات الخلية برفق في مليلتر واحد من وسائط PHA ، وأكمل الحجم إلى 20 مل بنفس غطاء الوسائط للأنبوب بشكل فضفاض للسماح للهواء بالدخول. احتضان الأنبوب طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا الليمفاوية الهادئة بالتحول إلى الخلايا الليمفاوية سريعة التكاثر.

شد الأغطية تماما وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطفية عن طريق الشفط. حبيبات الخلية برفق في مليلتر واحد من الوسائط الكاملة.

أكمل الحجم إلى 20 مل بنفس الوسائط وقم بتغطية الأنبوب بشكل فضفاض طوال الليل لتوسيع أعداد الخلايا. بعد غسلتين ب 10 ملليلتر من RPMI 1640 ، قم بتعليق حبيبات الخلية برفق في 600 ميكرولتر من RPMI 1640. قم بقياس تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام عداد الخلايا الآلي ومحلل الجدوى.

ثم أضف حجما مناسبا من RPMI 1640 للتكيف مع تركيز الخلية 1.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 20 ميكرولترا. انقل 100 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوبين معقمين سعة 1.5 ملليلتر. أضف العظم المؤتلف في أنبوب واحد إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر.

أضف حجما متساويا من PBS إلى الأنبوب الثاني. امزج كل حالة برفق عن طريق سحب العينات مرتين باستخدام ماصة معقمة مضبوطة على سعة 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من RPMI 1640 إلى كل بئر من الطرد المركزي 96 Well ، اللوحة عند 200 GS لمدة ثلاث دقائق لإزالة أي فقاعات هواء لنقل الخلايا من أنبوب إلى صفيحة دقيقة.

قم بتمرير الماصة برفق لأعلى ولأسفل مرة واحدة لضمان تعليق موحد للخلايا. بذور 40 ميكرولترا من تعليق الخلية لكل بئر في مكررة رباعية للخلايا غير المعالجة وفي نسخ مكررة للخلايا المعالجة ROPN أو PBS. اترك صفيحة الخلية تحت الغطاء المعقم لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالراحة والاستقرار بالتساوي في قاع البئر.

لتحسين تأثير ثقافة OPN ، تقوم الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بموازنة الثقافات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا. في هذه الأثناء ، قم بإعداد مليلتر واحد من 100 ميكرومولار سوماتوستاتين وأيزوبروتيرينول في RPMI 1640. املأ اللوحة المركبة عن طريق توزيع 20 ميكرولتر في الآبار المناسبة.

قم بتغطية اللوحة المركبة بختم قابل للشفاء. قم بتحميل أطراف ماصة اللوحة واللوحة المركبة في النظام القائم على CDS. قم بتسمية اللوحة في برنامج الأدوات المستند إلى CDS.

انتقل إلى قائمة البروتوكولات وحدد البروتوكول المناسب لبدء البروتوكول. انقر فوق ابدأ. يضيف نظام السوائل المتكامل المركبات في وقت واحد إلى جميع الآبار.

يقوم النظام القائم على CDS تلقائيا بجمع البيانات لمدة 15 دقيقة بعد أن كانت صلاحية خلية الإصدار المركب قابلة للمقارنة بين جميع العينات بقيم متسقة في حدود 86 و 96٪ في المقابل ، لوحظت اختلافات كبيرة في أعداد الخلايا. من بين عينات من 32 عينة ، كانت عينتان مستخدمتان لديهما عدد غير كاف من الخلايا ولم يتم تصنيفهما. يوضح هذا المثال التصنيف الوظيفي وفقا لدرجة عدم التوازن بين إشارات المؤشر الجغرافي والمؤشر الجغرافي.

تقييم تأثير OPN استجابة لتحفيز الجهاز الهضمي أن OPN زاد من الاستجابة في المرضى 353 و 371. في المقابل ، انخفضت الاستجابة بأكثر من 50٪ في المرضى 345 و 382 وأقل من 50٪ في المريض 370 بعد علاج ROPN. لذلك وفقا لمعايير التصنيف الخاصة بنا ، تمكنا من تصنيف المرضى 353 و 371 في FG واحد ، 300 من 45 و 382 في FG الثاني والمريض 370 في FG الثالث.

في موازاة ذلك ، تم فحص جميع المرضى لاستجابتهم لتحفيز بروتين الجهاز الهضمي ومقارنتهم بالأشخاص الخاضعين للتحكم. كما هو متوقع ، كان جميع المرضى أقل استجابة من الأشخاص الخاضعين للتحكم. أظهر المرضى المصنفون في نفس المجموعة الوظيفية مستويات مماثلة من الاستجابة القصوى.

تصنيف مجموعة كبيرة من مرضى SC الذين يتم اتباعهم بانتظام في عيادتنا الخاصة في مستشفى سان جوستين أن المجموعات الوظيفية الثلاث تم توزيعها بشكل مماثل. من بين الحالات المتوسطة ، كان FG الثاني هو السائد بين الحالات الشديدة. بعد انتظار هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيف المريض إلى مجموعتين أو ثلاث مجموعات وظيفية باستخدام التحليل الطيفي العازل الخلوي.