استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة: طريقة فعالة للكشف عن أنواع الخلايا السلفية وتحديدها أثناء تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء استرجاع المستضد على أنسجة دماغ الحصين لتصور أنواع الخلايا السلفية بشكل أفضل التي تؤدي إلى ظهور الخلايا العصبية حديثي الولادة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الدماغ المنفخ أولا من قطع الفأر الرقيقة للأقسام الإكليلية ، وتركيب هذه الأقسام على شريحة زجاجية ، مصممة خصيصا للالتصاق بقوة بالأنسجة. الخطوة الثانية هي غلي الشرائح بالمناديل الورقية وعلاج كاي التأتبي وإتاحة الوقت الكافي للتبريد.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأنسجة طوال الليل بالأجسام المضادة الأولية. الخطوة الأخيرة هي إجراء تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية على الأنسجة في اليوم التالي لمدة ساعتين على الأقل. في النهاية ، تصور أنواع الخلايا المؤيدة للجنس المختلفة عبر مراحل التطور المختلفة أثناء تكوين الخلايا العصبية للبالغين لأنسجة الحصين مع الفاصل الزمني أو الفحص المجهري متحد البؤر.

مرحبا ، اسمي هون جو ، باحث ما بعد الدكتوراه ، عضو في مختبر الدكتور إيان جون ومايو كلينك. ينصب تركيزنا الرئيسي في John Lab على التحقيق في عملية تكوين الخلايا العصبية الأخرى في الاضطرابات العصبية والنفسية. هدفنا النهائي هو ترجمة هذه المعرفة بنجاح إلى تطبيق علاجي يوضح أن إجراءنا لاسترداد المستضد سيكون Quam Hui ، ومرحبا جون من مختبرنا.

الميزة الرئيسية لتقنيتنا على الطرق الحالية للكيمياء المناعية هي أنها تسمح بالتصور الفعال لأنواع الخلايا المتميزة أثناء تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين. يمكن تصنيف هذه الأنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية السليفة التي يصعب اكتشافها ، وتصورها بكفاءة باستخدام طريقتنا في استرجاع المستضد. ستوفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتطور وتنظيم الخلايا العصبية لحديثي الولادة أثناء تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين.

بالنسبة للمهتمين بدراسة الاضطرابات النفسية والعلاج الدوائي ، فإن استرجاع المستضد لدينا سيكون مفيدا في التحقيق في دور تطور الخلايا العصبية أثناء هذا المرض. التسبب في المرض. ابدأ الإجراء بوضع الدماغ من فأر منحشر في 4٪ بارا فورمالديهايد في أنبوب مخروطي 10 ملليلتر طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، أو لمدة 12 إلى 24 ساعة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 36 ساعة للتثبيت الكامل. بعد التثبيت طوال الليل ، قم بإزالة PFA واترك الدماغ في الأنبوب المخروطي.

بعد ذلك ، اشطف الدماغ بنسبة 30٪ من السكروز لإزالة أي بقايا من PFA والتخلص من السكروز. ثم املأ الأنبوب بنسبة 30٪ من السكروز مرة أخرى واحتفظ به عند أربع درجات مئوية حتى يغرق الدماغ في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتقطيع الحصين إلى أقسام دماغية بحجم 40 ميكرومتر على ميكروتوم.

احتفظ بالأقسام الموجودة في محلول التجمد حتى تصبح جاهزة للكيمياء المناعية. ثم قم بتركيب الشرائح على شرائح المجهر المصممة خصيصا للالتصاق بالأنسجة بقوة. بعد تركيب المنديل ، اترك الشرائح تجف لمدة 10 دقائق.

يمكن تسريع التجفيف إذا كانت الشرائح مثبتة على سطح عمودي على منشفة ورقية لضمان الإزالة الكاملة للمواد الكيميائية السابقة. بمجرد أن تجف الشرائح ، اغسلها باستخدام PB S3 مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم اتركه يجف مرة أخرى.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول غليان الأنسجة وفقا للوصف الوارد في المخطوطة المصاحبة. بعد ذلك ، قم بغلي المحلول لمدة خمس دقائق في ميكروويف قياسي في الإعداد القياسي. بمجرد اكتمال الغليان ، قم بإزالة الحاوية بعناية من الميكروويف.

بعد ذلك ، انقل الشرائح المجففة إلى المحلول. تأكد من أن الجانب الذي يحتوي على أقسام الحصين معرض تماما للمحلول. إذا أمكن ، ضع الشرائح بزاوية على جدران الحاوية وقم بتكديس الشرائح الأخرى حولها.

ثم اغلي المزيج مع الشرائح لمدة سبع دقائق في الميكروويف في الإعدادات القياسية. في غضون ذلك ، املأ دلاء ثلج في منتصف الطريق بالثلج. بمجرد اكتمال الغليان ، أخرج الحاوية من الميكروويف وضعها داخل أحد دلاء الثلج.

صب باقي الثلج من الدلو الآخر في جميع أنحاء الحاوية وقم بتغطيته بالكامل. بعد ذلك ، اتركه لمدة ساعة بعد ساعة. قم بإزالة الشرائح من الحاوية.

اغسلها باستخدام TBST Buffer ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، جفف الشرائح في الظلام لمدة خمس إلى 10 دقائق أو حتى تجف الشريحة تماما. في غضون ذلك ، قم بإعداد غرفة بها DDH two O لتلوين الأجسام المضادة الأولية طوال الليل.

بمجرد أن تجف الشرائح ، ارسم مخططا حول أقسام الأنسجة باستخدام قلم مستأنف مائي. يعمل هذا المخطط كحاجز لمنع خليط الأجسام المضادة من التدفق. ثم تحضير خليط الأجسام المضادة الأولية في T-B-S-T-T.

ضع الشرائح المجففة على المسرح في غرفة التلوين. أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي ببطء لتغطية السطح بالكامل. بعد ذلك ، قم بتغطية غرفة التلوين لحجب الضوء الخارجي واحتفظ بها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، واغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام عازلة TBST.

بعد ذلك ، جففها في الظلام. الآن قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوية في T-B-S-T-T. ثم ضع الشرائح الجافة في غرفة التلوين.

أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي. قم بتغطية غرفة التلوين ببطء واحفظها بعيدا عن الضوء الخارجي لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة بعد الانتهاء من التلوين الثانوي ، واغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام TBST buffer ، وجفف الشرائح في الظلام بعد التجفيف. أضف حل التركيب إلى الشرائح.

قم بتغطيتها بزلات غطاء بعناية لمنع إدخال أي فقاعات. ثم احتفظ بالشرائح في الظلام لمدة ساعتين على الأقل قبل التحليل اللاحق وإجراء الفاصل الزمني أو تحليل المحادثة على الأنسجة الملطخة. يتم تصوير تكوين الخلايا العصبية للحصين البالغ عبر المنطقة الحبيبية الفرعية للتلفيف المسنن.

تمر الخلايا الدبقية الشعاعية المنشطة مثل الخلية الجذعية من النوع الأول عبر مراحل مميزة حيث تتمايز وتنضج وتتكامل وظيفيا مع مورفولوجيا متقنة في الدائرة العصبية. يمكن تحديد كل مرحلة من المراحل وأنواع الخلايا المعنية بناء على تعبيرها عن مجموعة من العلامات. MCM two هو علامة تكاثر يتم التعبير عنها عبر جميع أنواع الخلايا السلفية الانقسامية بينما يتم التعبير عن النين بين الخلايا الدبقية الشعاعية وغير الشعاعية مثل الخلايا الجذعية.

نظرا لأن النوع الثاني من النوع A يميز ، يتم إيقاف تشغيل التعبير المتداخل أولا. Anti TBR يزيد تعبيران في السلف بعد الانقسامي MCM يتم فقدان تعبيرين بينما يملي تعبير DCX و NEWAN الهجرة والنضج إلى خلية عصبية وظيفية. هذه صورة متحدة البؤر تمثيلية ل MCM الأرجواني ، اثنان من neston الأخضر والأحمر الداكن.

تظهر الصور المكبرة في المربعات GL شعاعي مثل السلف الذي يعبر عن neston و MCM two و dpi. فيما يلي صورة متحدة البؤر تمثيلية ل MCM الأزرق واثنين من الأحمر و TBR اثنين من DCX الأخضر والرمادي نقطة في البوصة. يظهر تلطيخ خاصية نوع الخلية السلفية من النوع الثاني B في الصور المكبرة في المربعات التي تعبر عن MCM two و TBR 2D و c و X و dpi.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ثلاثة أشياء. أولا ، استخدم الأنسجة المثبتة والثابتة بشكل جيد من سمك الإكليل الأيمن. ثانيا ، تركيب الأنسجة بشكل مسطح على الشرائح ومنع أي ضرر أثناء القيام بذلك.

وأخيرا ، ثلاثة ، مما يتيح وقتا كافيا للغليان والتبريد اللاحق أثناء استرجاع المستضد. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل إعادة بناء الأنسجة متحد البؤر والتجارب السلوكية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية فيما يتعلق بكيفية دمج الخلايا العصبية حديثي الولادة في دوائر الحصين والمساهمة في الوظيفة المعرفية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء استرداد المستضد على أنسجة الحصين لتصور بفعالية أكبر ، أنواع الخلايا الحاضرة التي تؤدي إلى ظهور خلايا عصبية جديدة أثناء العصاب في الحصين الآخر.