بروتوكول سريع لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات ذات معدل انتقال مرتفع في جينوم C. ايليجانس

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في دمج مصفوفات عابرة للكروموسومات من سلالات معدلة وراثياً في جينوم *Serratus elegance* باستخدام التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية. أولاً، اختر السلالة المعدلة وراثياً ذات أعلى معدل انتقال ممكن، ويفضل أن يكون أكبر من 80%. بعد ذلك، قم بتشعيع يرقات المرحلة الرابعة (L4) المعدلة وراثياً والمختارة بالأشعة فوق البنفسجية، ثم افصل أربعة حيوانات فلورية معدلة وراثياً من جيل F2 من كل طبق F1 مختار. أخيراً، افحص أطباق جيل F2 بحثاً عن حيوانات معدلة وراثياً فلورية بنسبة 100%.

الجيل الثالث من الديدان. وفي النهاية، يمكن أن يظهر اختيار حيوانات فلورية من الجيل الثالث وراثة بنسبة 100% للجين المنقول. وهذا النهج التجريبي مناسب تماماً للسلالات المعدلة وراثياً التي تنقل مصفوفات كروموسومية إضافية بمعدل مرتفع.

ستقوم ستيفاني بيلمان، الفنية في مختبرنا، بتوضيح الإجراء. ابدأ باستخدام 500 طبق بتري كبير يحتوي على وسط نمو النيماتودا. قم بتلقيح كل طبق بـ 0.3 milliliters من بكتيريا isia coli المشبعة.

مزرعة OP 50. قم بتقييم معدل انتقال السلالة المعدلة وراثياً المراد دمجها لكل سلالة معدلة وراثياً. اختر 10 بالغين فلوريين بالجاذبية وانقلهم إلى 10 أطباق مزرعة منفصلة باستخدام مجهر ستيريو فلوري.

توضع الحيوانات في حاضنة ديدان مضبوطة عند درجة حرارة تسمح بتكاثر الخلفية الجينية. يتم مراقبة النسل يومياً لتقييم المرحلة التطورية التي يتم فيها التعبير عن علامة الحقن المشترك، والتي يمكن رصدها بشكل أفضل باستخدام المجهر الفلوري. يتم تقييم معدل انتقال الصفة في النسل عن طريق تحديد النسبة المئوية للنسل الفلوري.

بالنسبة لدمج الجين المنقول، اختر السلالة المعدلة وراثياً ذات أعلى معدل انتقال. احصل على مجموعة من الحيوانات المعدلة وراثياً المتزامنة في المرحلة اليرقية الرابعة L4. لعملية الدمج، انقل 30 بالغاً من GRA الفلورية إلى خمسة أطباق زراعة.

بعد أن تضع الديدان البيض لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات عند 15 degrees Celsius، تحقق من وجود 30 بيضة على الأقل في كل طبق، ثم تخلص من الديدان البالغة من الأطباق. قم باستزراع الحيوانات في حاضنة ديدان حتى تصل الأجيال الناتجة إلى المرحلة اليرقية L four. ضع كل طبق يحتوي على 15 إلى 20 حيواناً من المرحلة L four المعدلة وراثياً والمستشعرة فلوريسنتياً في جهاز الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker) مع إزالة الأغطية، وقم بتعريض الديدان للإشعاع من أجل الاستعادة. قم بحضن الديدان المشععة طوال الليل عند 15 degrees Celsius.

تحقق من عدد الحيوانات الحية في يديك. يُعد معدل البقاء على قيد الحياة الذي يتراوح بين 80 إلى 90% مناسباً لضمان عملية تشعيع فعالة. قم بتربية الحيوانات المشععة عند درجة حرارة تتراوح من 15 إلى 25 درجة Celsius حتى تصل النسل إلى المرحلة النمائية التي تسمح بمراقبة تعبير علامة الحقن المشترك.

انقل حيوانات F1 الفلورية المنفردة إلى أطباق زراعة منفصلة. احتفظ بأطباق F1 هذه في درجة حرارة تتراوح بين 15 إلى 25 درجة Celsius حتى تصل الأجيال الناتجة إلى المرحلة المناسبة لملاحظة حيوانات F2 الفلورية، وذلك بناءً على المؤشر المشترك المستخدم. في هذه الحالة تحديداً، تمت ملاحظة الديدان في مرحلة البلوغ، مع التخلص من جميع أطباق F1 التي أظهرت إما: واحد، عدم وجود نسل، مما يشير إلى أن حيوان F1 كان عقيماً أو مات، أو اثنان، عدم وجود أو وجود عدد قليل فقط من حيوانات F2 الفلورية، مما يشير إلى أن حيوان F1 لم ينقل الجين المنقول بالمعدل المتوقع.

اختر أربعة حيوانات من الجيل الثاني (F two) المعدلة وراثياً والفلورية من كل طبق F1 مختار. عند استخدام الجينات الفلورية المنقولة، اختر ديدان الجيل الثاني ذات المستوى العالي من الفلورية، حيث قد يشير ذلك إلى أن هذه الحيوانات متماثلة الزيجوت للمصفوفة المدمجة. لاحظ أنه عند اختيار حيوانات الجيل الثاني، من الضروري عدم نقل البيض أو اليرقات لتجنب حدوث نتائج سلبية كاذبة في الخطوة التالية.

بعد تنمية حيوانات الجيل الثاني F two، يتم فحص أطباق الجيل الثاني بحثاً عن ديدان الجيل الثالث F three المعدلة وراثياً والمفلورة بنسبة 100%. وتعد عملية الفحص سريعة للغاية، حيث إن وجود دودة واحدة غير مفلورة يشير إلى وجوب التخلص من الطبق. يتم عزل ثمانية حيوانات مفلورة من الجيل الثالث F three من الأطباق المختارة للتأكد من توريث transgene بنسبة 100%. وإذا كان ذلك ممكناً، يجب الاحتفاظ بعدة سلالات معدلة وراثياً ومدمجة ومستقلة.

تم إجراء عمليات دمج للجينات المنقولة في سلالتين مختلفتين، حيث تم نقل مصفوفات خارج كروموسومية بنفس التردد تقريبًا. وبمقارنة البروتوكول القياسي والبروتوكول المُحسن، تبين أن الوقت وعدد الأطباق اللازمة لكل سلالة مدمجة قد تم تحسينهما في البروتوكول المُحسن. بعد ذلك، اختبرنا الفرضية القائلة بأن ارتفاع معدل انتقال الجين المنقول في سلالة غير مدمجة يسهل عملية دمج الجين المنقول في الجينوم.

تم دمج جين منتقل واحد في سلالات تنتقل بمعدلات مختلفة باستخدام البروتوكول المُحسن للسلالة ذات أعلى معدل انتقال. تم استعادة ثلاث سلالات مدمجة من 90 حيواناً فقط من الجيل الأول (F1) المختار، بينما بالنسبة للسلالة المعدلة وراثياً التي تنتقل بنسبة 50 إلى 60%، تم استعادة سلالة مدمجة واحدة من 110 حيوانات مختارة من الجيل الأول (F1). عقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق مختلفة للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد التعبير الجيني ونمطه وتنظيمه، أو تحديد تموضع البروتين وفرط تعبير البروتين، أو تطوير علامات تحت خلوية.