بروتوكول سريع لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات ذات معدل انتقال مرتفع في جينوم C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج مصفوفات الكروموسومات الإضافية المعدلة وراثيا في جينوم الأناقة المنشارية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. أولا ، حدد الخط المعدل وراثيا بأعلى معدل نقل ممكن ، من الناحية المثالية أكبر من 80٪ ثم تشع الأشعة فوق البنفسجية الأربعة يرقات المعدلة وراثيا المختارة L أربعة من الفلورسنت المعدلة وراثيا F من كل لوحة F1 المحددة. الشاشة التالية ، الصفيحتان F لمعدل وراثيا فلوري بنسبة 100٪.

F ثلاث ديدان. في النهاية ، يمكن أن يظهر اختيار فلورية من الجيل F الثلاثة وراثة 100٪ للجين المعدل وراثة. هذا النهج التجريبي مناسب تماما للخطوط المعدلة وراثيا التي تنقل مصفوفات كروموسومات إضافية بمعدل مرتفع.

ستظهر الإجراء ستيفاني بيلمان ، فنية من مختبرنا. ابدأ ب 500 طبق بتري كبير يحتوي على نمو الديدان الخيطية. بذور متوسطة كل طبق يحتوي على 0.3 مل من إيسيا القولونية المشبعة.

ثقافة OP 50. تقييم معدل انتقال الخط المعدل وراثيا المراد دمجه لكل خط معدل وراثيا. اختر 10 بالغين من الجاذبية الفلورية في 10 لوحات استزراع منفصلة تحت ثقافة مجسم الفلورسنت.

تم تعيين في حاضنة الدودة عند درجة حرارة تسمح بتكاثر الخلفية الجينية. راقب النسل كل يوم لتقييم مرحلة النمو التي يتم فيها التعبير عن علامة الحقن المشترك ويمكن ملاحظتها بشكل أفضل باستخدام تنظير الفلورسنت. تقييم معدل انتقال النسل من خلال تحديد النسبة المئوية لذرية الفلورسنت.

لتكامل الجينات المعدلة وراثيا ، حدد الخط المعدل وراثيا بأعلى معدل إرسال. احصل على مجموعة من المعدلة وراثيا متزامنة في مرحلة اليرقات الأربعة L. للتكامل ، اختر 30 من البالغين الفلورسنت GRA في خمس لوحات ثقافة.

بعد أن تضع الديدان البيض لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 15 درجة مئوية ، تحقق من وجود 30 بيضة على الأقل حسب الطبق ثم تخلص من البالغين من الصفائح التي تزرع في حاضنة الديدان حتى تصل النسل إلى مرحلة اليرقات الأربعة L. ضع كل صفيحة تحتوي على 15 إلى 20 معدليا وراثيا فلوريا في رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية مع إزالة الأغطية ، وقم بإشعاع الديدان للتعافي. احتضان الديدان المشعة طوال الليل عند 15 درجة مئوية.

تحقق من عدد التي تعيش في أيدينا. معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 80 إلى 90٪ يتم تكييفه من أجل تشعيع فعال. قم بزراعة المشععة عند 15 إلى 25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى مرحلة النمو ، مما يسمح بملاحظة تعبير علامة الحقن المشترك.

انقل F1 الفلورية المفردة إلى ألواح استزراع منفصلة. احتفظ بألواح F1 هذه عند 15 إلى 25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى المرحلة المناسبة لمراقبة حيوانين فلوريين F اعتمادا على العلامة المشتركة المستخدمة. في هذه الحالة بالذات ، لاحظنا أن الديدان عندما يتخلص البالغون من جميع لوحات F1 التي تظهر إما واحدة ، ولا يوجد ذرية ، مما يشير إلى أن F1 كان معقما أو مات ، أو اثنان لا ، أو فقط عدد قليل من الفلورية F اثنين مما يشير إلى أن F1 لم ينقل الجينات المعدلة بالمعدل المتوقع.

حدد أربعة معدلة وراثيا فلورية من كل لوحة F1 محددة. عند استخدام الجينات المعدلة والفلورسنت ، اختر F ديدتين بمستوى عال من التألق لأن هذا قد يشير إلى أن هذه متماثلة اللواقح للمصفوفة المتكاملة. لاحظ أنه عند قطف حيوانين ، من الأهمية بمكان عدم حمل البيض أو اليرقات لتجنب السلبيات الكاذبة في الخطوة التالية.

بعد زراعة F ، يقوم حيوانان بفحص الصفيحتين F بحثا عن 100٪ من الديدان الفلورية المعدلة وراثيا F الثلاثة. الشاشة سريعة جدا حيث يشير وجود دودة واحدة غير فلورية إلى أنه يجب التخلص من اللوحة ، وتمييز ثمانية فلورية F من لوحات مختارة لتأكيد وراثة الجينات المعدلة وراثيا بنسبة 100٪. إذا أمكن ، احتفظ بالعديد من السلالات المعدلة وراثيا المستقلة المتكاملة.

تم إجراء عمليات تكامل للجينات المعدلة وراثيا في خطين مختلفين ، ونقل مصفوفات كروموسومية إضافية بنفس التردد تقريبا. باستخدام البروتوكولات القياسية والمحسنة ، يتم تحسين الوقت وعدد اللوحات اللازمة لكل خط متكامل في البروتوكول المحسن. بعد ذلك ، اختبرنا الفرضية القائلة بأن معدل انتقال الجينات المعدلة وراثيا أعلى في خط غير متكامل يجعل دمج الجين المعدل في الجينوم أسهل.

تم دمج جين معين معين في خطوط الإرسال بمعدلات مختلفة باستخدام البروتوكول المحسن لأعلى خط إرسال. تم استرداد ثلاثة خطوط متكاملة من 90 مختارا فقط من F1 بينما تم استرداد خط متكامل واحد من 110 F1 مختارة بالنسبة للخط المعدل وراثيا عند 50 إلى 60٪. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق مختلفة للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد التعبير الجيني ، والنمط والتنظيم ، وتوطين البروتين والإفراط في التعبير عن البروتين ، أو تطوير علامات تحت الخلوية.