إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

للحفاظ على العمليات العصبية لتحليل التركيبية، ونحن تصف بروتوكول للتصفيح من الخلايا العصبية في المقام الأول على شبكات المجهر الإلكتروني تليها فلاش تجميد، مما أسفر عن عينات معلقة في طبقة من الجليد الزجاجي. يمكن فحص هذه العينات باستخدام المجهر البرد الإلكترون لتصور هياكل على مقياس متناهي الصغر.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنمية الخلايا العصبية الأولية للفئران بطريقة تجعل الخلايا العصبية مناسبة للتصور عن طريق المجهر الإلكتروني بالتبريد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الأطباق أولا بشبكات EM لطلاء الخلايا العصبية الأولية. الخطوة الثانية هي تحضير الخلايا العصبية الأولية ووضعها على شبكات EM.

بعد ذلك ، يتم إجراء تزجيج الخلايا العصبية على شبكات EM. الخطوة الأخيرة هي جمع الصور عن طريق المجهر الإلكتروني بالتبريد ، متبوعا بالمعالجة اللاحقة والتعليق التوضيحي. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد والتصوير المقطعي لإظهار البنية الفائقة للعصبيات في حالة رطبة مجمدة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن استخدامها للتصور ثلاثي الأبعاد للعصبيات الرطبة المجمدة بدقة نانومتر دون استخدام المثبتات الكيميائية. لذلك ، تسهيل تقييم الخصائص المورفولوجية الأقرب إلى الحالة الأصلية. ابدأ هذا الإجراء بفحص سلامة الكربون المقدس على شبكات EM الذهبية.

باستخدام مجهر ضوئي بتكبير لا يقل عن 25 مرة ، تأكد من أن ثقوب الكربون أكبر من 98٪ سليمة. للطلاء ، استخدم الخلايا العصبية الأولية موقد بنسن لتعقيم شبكات EM باللهب وجعلها محبة للماء في نفس الوقت. انقل الشبكة على الفور مع جانب الكربون لأعلى إلى وسط الزجاج.

الطبق السفلي ، ضع شبكة EM واحدة لكل طبق واستخدم فقط أطباق القاع الزجاجية المعقمة مسبقا. ثم استخدم مجهرا ضوئيا للتحقق من سلامة الشبكة مع الاستمرار في الاحتفاظ بشبكة EM داخل الطبق السفلي الزجاجي في غطاء لزراعة الأنسجة ، ضع 250 ميكرولترا من مادة الطلاء المناسبة على المنطقة الزجاجية المركزية لطبق بتري. ببطء وحذر ، تأكد من أن مادة الطلاء المناسبة تغطي شبكة E EM بأكملها.

بعد ذلك ، قم بتغطية طبق بتري بغطاءه واحتضان العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط كل خليط البوليول ليسين من الأطباق بطرف ماصة معقم متصل بالأنبوب المفرغ في الغطاء. تجنب الاتصال المباشر بشبكة E EM.

بعد ذلك، استخدم ماصة إزاحة الهواء القابلة للتعديل لتطبيق 250 ميكرولتر من PBS المعقم بعناية لتغطية شبكة EM بالكامل في المنطقة الزجاجية المركزية لكل طبق بتري. ثم استنشق PBS من كل طبق. كرر الإجراء ثلاث مرات بعد ذلك.

اترك الأطباق ذات الشبكات EM تجف في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. التحقق تحت المجهر الضوئي. تأكد من أنها جافة تماما وعدم وجود فقاعات رطوبة في الشبكة.

خلاف ذلك ، قم بالشفيق بعناية بجوار شبكة EM للتخلص من هذه الرطوبة الزائدة ، يجب استخدام الشبكة المطلية على الفور لطلاء الخلايا العصبية. في هذا الإجراء ، احسب الحجم المناسب للخلايا لكل طبق من أجل تحقيق تركيز 50 ، 000 خلية لكل مليلتر لكل طبق. يجب أن يكون الحد الأقصى لكمية التطبيق 250 ميكرولتر لملء مساحة الزجاج المركزية فقط ، وليس الطبق بأكمله.

بعد ذلك ، احتضن الأطباق لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالتعافي والالتصاق بعد 30 دقيقة ، أضف ببطء 1.5 مل من وسائط الخلية الدافئة إلى كل طبق وتجنب لمس شبكة EM للخلايا العصبية في الحصين. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي ثم قم بتغيير نصف الوسائط كل يومين لمدة 14 يوما. في هذا الإجراء ، قم بإعداد المعدات وجميع المواد لتجميد وتخزين شبكات الذهب EM في درجة حرارة مبردة ، والتي تشمل جهاز تزجيج مع غرفة رطوبة ، وورق ترشيح خال من الكالسيوم ، وزوج من ملاقط طويلة مسطحة ، وزوج من الملقط المتخصص بالنقاط الدقيقة لآلة التزجيج ، وعامل النيتروجين السائل ، حاوية سائل التبريد ، وصندوق تخزين شبكة EM.

بعد ذلك قم بتشغيل جهاز التزجيج. اضبط الرطوبة على 100٪ ودرجة الحرارة على 32 درجة مئوية. في قسم الخيارات ، اضبط وقت الحظر على صفر ثانية.

هذا يسمح بالنشاف اليدوي من خلال النافذة الجانبية لغرفة الرطوبة. ثم قم بتكديس ثلاثة أوراق ترشيح خالية من الكالسيوم. قم بقص المكدس إلى شرائح بعرض 0.5 سم يبلغ طولها حوالي سنتيمترين بعد ذلك ، وثنيها بزاوية 90 درجة بحيث يكون جزء واحد من الورق 0.5 سم × 0.5 سم.

سيتم استخدام هذا القسم لنشاف العينة. قم بإزالة الورق الأوسط وضعه على ورق ترشيح آخر خال من الكالسيوم حتى الاستخدام. بعد ذلك ، استخدم التزجيج المتخصص للملاقط لاختيار شبكة EM بعناية من الطبق.

لاحظ جانب شبكة EM التي تنمو عليها الخلايا العصبية لأن الموضع سيكون مهما للخطوة التالية. ثم استخدم القفل المنزلق الأسود الموجود على الملقط لقفل الملقط بإحكام على شبكة EM. الآن أدخل الملقط في آلة التزجيج بحيث يكون جانب الشبكة الكهرومغناطيسية التي تلتصق بها الخلايا العصبية متجها إلى اليسار وبعيدا عن فتحة الفتح الدائرية على جانب آلة التزجيج.

ثم اسحب الملقط الذي يحمل شبكة EM في آلة التزجيج. بعد ذلك ، ضع حاوية سائل التبريد المملوءة ب LN two الكافي والإيثان السائل في الحامل المناسب لآلة التزجيج باستخدام أمر الشاشة المناسب لآلة التزجيج. ارفع حجرة سائل التبريد لأعلى حتى يتم شطفها بقاع حجرة الرطوبة باستخدام ملاقط النقطة المسطحة.

أمسك إحدى حواف ورق الترشيح بحيث يكون الجانب الأقصر عموديا على الملقط. سوف يتلامس هذا الوجه بشكل مباشر مع شبكة EM للنشاف. الآن ، أدخل ورق الترشيح بعناية في الفتحة الجانبية لغرفة الرطوبة بثبات أمسك الورق مقابل شبكة EM لمدة 10 ثوان ، وتخلص من الورق واغمر على الفور.

قم بتجميد العينة في الإيثان السائل باستخدام أتمتة آلة التزجيج. بعد ذلك ، انقل شبكة EM الرطبة المجمدة بعناية إلى إحدى الفتحات الموجودة في تخزين الشبكة. هذه صورة مجهرية ضوئية للمنطقة المركزية لشبكة EM بتكبير 10 أضعاف التي تنمو عليها الخلايا العصبية الأولية للفئران لمدة أسبوعين.

فيما يلي المنظر المكبر للصندوق المائي حيث يتم ملاحظة الخلايا العصبية وإسقاطاتها العصبية. هذا هو صورة مجهرية إلكترونية لعصبية بارزة للخارج من جسم الخلايا العصبية بتكبير 4K. ينظر إلى المربع الأزرق عن قرب هنا حيث تظهر السمات الداخلية للعصبيات بوضوح عند تكبير 20 كلفن.

يظهر هذا الفيديو كومة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها من الصور المجهرية للعصبية من الثقافة الأولية للخلايا العصبية في الحصين الفئران. يتم تصويره باستخدام التصوير المقطعي ويتبعه التعليق التوضيحي الملون ثلاثي الأبعاد المقابل. فيما يلي مقطع فيديو آخر يظهر كومة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها من الصور لمحور عصبي عقدي جذر الفئران الذي تم جمعه باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد متبوعا بالتعليق التوضيحي ثلاثي الأبعاد المقابل والموضح هنا هو مونتاج لأربع صور ثنائية الأبعاد cryo-EM لمحور عصبي عقدي جذر ظهري منفصل للفئران تم التقاطها بتكبير 20 كلفن.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا العصبية الأولية على شبكات المجهر الإلكتروني بطريقة مناسبة لتصور الخلايا العصبية في حالة رطبة مجمدة باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد.