Name: الرنا الميكروي في الوضع الطبيعي التهجين للأنسجة الكلى الفورمالين الثابتة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: تعلم تقنية التهجين الموضعي لتحديد وتقدير التعبير عن الرنا الميكروي في أنسجة الكلى الثابتة بالفورمالين. تُظهر الطريقة توزيع الرنا الميكروي في أجزاء الكلى المختلفة باستخدام مسبار مُوسوم بالديجوكسيجينين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح HL082798 HL111580 و.

1. أقسام الكلى الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الثابتة الفورمالين (10٪) أقسام الكلى جزءا لا يتجزأ من البارافين على شرائح المجهر في سمك 5 ملم باستخدام ميكرومولار HM 355 S. ويمكن تخزين الشرائح لعدة أشهر قبل التحليل. </li></ol> 2. إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X في DDH 2 O في أعلى زجاجة المسمار autoclavable. ملء زجاجة أخرى مع 1 لتر من DDH 2 O. إضافة 1 مل من DEPC إلى كل زجاجة، وغطاء ويهز بقوة. السماح للحلول الجلوس بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتدمير RNAses ثم الأوتوكلاف. إضافة 400 مل توين-L 20-1 من برنامج تلفزيوني 1X لجعل PBS-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بروتين K العازلة (50 mMTris، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 و 1 مم CaCl 2 في DEPC المياه المعالجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول 0.2٪ الجلايسين في برنامج تلفزيوني-T. </li></ol> 3. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كمية كبيرة من العازلة التهجين (50-100 مل) تتألف من 50٪ الفورماميد، 5X SSC، 0.1٪ توين، 9.2ملي حامض الستريك لتعديل درجة الحموضة إلى 6، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، و 500 ميكروغرام / مل الحمض النووي الريبي الخميرة في DEPC معاملة ده 2 O. تقسم إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البارافين من الأنسجة عن طريق غسل 3X في الزيلين الطازجة لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب أقسام الأنسجة بنسبة 5 دقيقة حضانات في خفض تركيزات الإيثانول (100٪، 75٪، 50٪، و 25٪) في DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الشرائح مع ما يكفي من DEPC لتغطية كامل أقسام الأنسجة (حوالي 0.4-0.5 مل) لمدة 1 دقيقة. جعل متأكد من الأنسجة لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح في DEPC معاملة PBS-T مرتين لمدة 5 دقائق، وجمع النفايات المحتوية DEPC للتخلص السليم. جميع الكواشف يجب DEPC المعالجة للقضاء على RNAses من هذه النقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm بروتين K العازلة وإضافة بروتين K إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية أقسام الأنسجة مع الحل K بروتين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة proteinasه K الحل وإضافة 0.2٪ الجلايسين في برنامج تلفزيوني-T لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح في DEPC معاملة PBS-T مرتين لمدة 30 ثانية لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح المقاطع في تقدم طازجة بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 4. تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من العازلة التهجين (50٪ الفورماميد، 5X SSC، 0.1٪ توين، 9.2 ملي حمض الستريك لتعديل درجة الحموضة إلى 6، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، 500 ميكروغرام / مل الحمض النووي الريبي الخميرة) في قسم الأنسجة، وتغطي مع ريبونوكلياز HybriSlips مجانا مجرد قطع أكبر من أقسام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام Prehybridize في الرطوبة تسيطر فرن التهجين لمدة 2 ساعة في درجة حرارة التهجين يحدد ل &#39;التحقيق 3 المسمى digoxigenin (عادة الحمض النووي تيم لجنة التحقيق -21 ° C، (أي 54 درجة مئوية لمدة مير 382، تحقيق DNA تيم = 75 ° C )، وذلك باستخدام مناديل مختبر الأنسجة غارقة في 50٪ formamide/50٪ 5X SSC للحفاظ على ترطيب الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التحقيق ميرنا، والسيطرة الايجابية (U6، RNA النووية الصغيرة) والسيطرة السلبية (تدافعتتسلسل) إلى 40 نانومتر في المنطقة العازلة التهجين (75 ميكرولتر من العازلة هو مطلوب في القسم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين التحقيق في المخزن التهجين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الفرن التهجين وإزالة coverslips والعازلة التهجين الزائدة من prehybridization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 75 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على التحقيق في قسم الأنسجة، مباشرة إلى الأنسجة. تغطية الأنسجة مع HybriSlips فقط كبيرة بما يكفي لتغطية أقسام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الشريحة مستوى حامل، والعودة إلى الفرن التهجين للحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة من الخطوة 4.2 (حوالي 16 ساعة). </li></ol> 5. التشدد غسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر 2X SSC، تسخينها إلى درجة حرارة التهجين، فقط تحت حافة واحدة لل coverslips للمساعدة في الافراج ساترة من الأنسجة. إزالة ساترة عن طريق إمالة الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في 200 ميكرولتر من 50٪ الفورماميد، 50٪ 2X SSC في التهجين 3X درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطفالشرائح في برنامج تلفزيوني 5X-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق كل يوم شاكر المداري على سرعة منخفضة. </li></ol> 6. كشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في عرقلة العازلة (2٪ الماعز أو مصل الحصان، 2 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني BSA-T) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري على سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع شظايا مكافحة DIG-AP فاب في عرقلة العازلة في 1:100. إضافة 100 ميكرولتر في قسم الأنسجة، وتغطي مع HybriSlips مجرد قطع كبيرة بما يكفي لتغطية هذا الباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الضد في غرفة ترطيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل (حوالي 16 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني-T 7X، لمدة 5 دقائق كل يوم شاكر المداري على سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح العازلة في AP (100 ملي TrisHCl درجة الحموضة 9.5 و 50 ملي MgCl 2، 100MM كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين 20) 3X، لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحل NBT / BCIP إلى عازلة AP (200 μl/10 العازلة مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400-500 مل من المخفف حل NBT / BCIP إلى كل شريحة لتغطية كامل جميع أقسام الأنسجة. تطوير في الظلام، ومستوى، humidifغرفة العبوات الناسفة لمدة 4-5 ساعة. </li></ol> 7. تصاعد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى المقاطع في زيادة تركيزات الإيثانول (25٪، 50٪، 75٪، 100٪) لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في 5X الزيلين من أجل مسح المقاطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح في Permount تصاعد المتوسطة وبين عشية وضحاها الجافة. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

كان الهدف من هذه المقالة لوصف بروتوكول لميرنا التهجين في الموقع الذي يعمل بشكل جيد في أنسجة الكلى الفورمالين الثابتة. بينما كان يعمل خارج هذا البروتوكول وقد تم تحديد العديد من المصادر المهمة للقطعة أثرية تلطيخ. يمكن الاهتمام الدقيق لهذه النقاط تساعد على تجنب تلطيخ قطعة أثرية وتزيد من احتمال تشغيل ISH ناجحة. يمكن أن يحدث واحد من أكثر الأسباب التي يمكن تجنبها من القطع الأثرية تلطيخ عندما أقسام الأنسجة تصبح...

الرنا الميكروي صغيرة (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) غير المكودة الرنا التي يتم إنتاجها التطور الطبيعي. أنها تعمل عادة لقمع بروتين تعبير من خلال القمع متعدية أو تدهور مرنا. miRNAs ربط لأهداف مرنا مع التكامل غير مكتملة، مما يجعل من الممكن لميرنا واحدة لقمع أهداف متعددة. فهم أي نوع من أنواع الخلايا والهياكل التعبير miRNAs هو جزء مهم من فهم الآليات التي من خلالها تغيرات في الخلية ميرنا التعبير وتأثير الظواهر الأنسجة. حين طرق مثل ميرنا التسلسل، QPCR والنشاف الشمالية يمكن استخدامها للكشف لل miRNAs في الأنسجة كله، لا يسمح هذا النهج واحد لتحديد أي نوع من الخلايا المحددة التي جاءت من داخل نسيج معين. تشريح المكونات الخلوية والهيكلية قبل التحليل باستخدام هذه الأساليب يمكن أن يكون صعبا للغاية والظروف اللازمة لتحقيق العزلة الكافية يمكن أن تؤدي إلى alterations في التعبير الجيني أو تدهور الرنا. الرنا الميكروي في الموقع التهجين هي الطريقة المستخدمة لتصور موقع الرنا الميكروي ومستويات التعبير في الأنسجة. هذا الأسلوب هو قيمة خاصة في الأنسجة تتكون من هياكل غير المتجانسة، مثل الكلى. وقد ثبت MicroRNAs للعب دور تنظيمي في 2،3 التنمية الكلى ووظائف الأعضاء 4. كما تبين التعديلات التعبير microRNA أن تشارك مع أمراض الكلى مثل التليف 5-10، اعتلال الكلية السكري 7، سرطان الكلى 11،12، وإصابة الكلى الحاد 13. في بحثنا، وجدنا أن تحسين الرنا الميكروي الموقع التهجين للأنسجة الكلى في كان قيمة لتحديد المواقع الهيكلية الدقيق ميرنا التعبير في كل من الصحة والمرض 14. تحديد التعبير أنبوبي والخلوية من microRNAs مختلفة أمر مهم لأن تنظيمها من تاقد يكون rgets تعتمد على الوظائف الخلوية. في الدول المريضة من المهم أيضا لتحديد كيفية إحداث تغييرات في التعبير ميرنا قد تؤثر على وظيفة. وكان الهدف من الطريقة الموصوفة هنا للبناء على منهجيات ISH القائمة التي وضعتها Kloosterman آخرون 15، 16،17 المحققين الآخرين، وتلك التي اقترحتها Exiqon 1 و تحسين طريقة لأنسجة الكلى الفورمالين الثابتة. وقد استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب لتحديد الاختلافات الإقليمية المتميزة في الكلى التعبير الرنا الميكروي مير-382 مع جانب واحد انسداد الحالب 18. ويمكن استخدام هذا النهج مع الأنسجة الأخرى كذلك، مع التحسين إضافية.

<table><tbody><tr><td>بارافورمالديهايد</td><td>سيجما</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>جيبكو</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل بيروكربونات</td><td>سيجما</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>توين -20</td><td>سيجما</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>زيلين</td><td>سيجما</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول</td><td>فائق النقاء</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life تقنيات</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td> <td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>سيجما</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC تقنيات الحياة العازلة</td><td></td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>هيبارين</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>تقنيات حياة الحمض النووي الريبي الخميرة</td><td></td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td> <td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>جي تي بيكر</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز ك</td><td>تخمير</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3 ' DIG- مسبار ميرنا</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3 ' DIG- مسبار miR مشوش</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3 ' DIG- U6 miR مسبار</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT / BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>فرن التهجين المنزلق</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr> مجموعة <tr><td>صينية الألومنيوم</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr> الفولاذ <tr><td>المقاوم للصدأ رف إدراج</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

الرنا الميكروي<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين للأنسجة الكلى الفورمالين الثابتة

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

في هذه المادة ونحن تصف طريقة للكشف اللونية من ميرنا في الكلى من خلال الموقع التهجين مع digoxigenin في المفتاحية تحقيقات الرنا الميكروي. هذا البروتوكول، وضعت أصلا من قبل Kloosterman وزملاؤه للاستخدام واسع النطاق مع تحقيقات Exiqon ميرنا 1، تم تعديل للتغلب على التحديات الكامنة في تحليل ميرنا في أنسجة الكلى. وتشمل هذه القضايا مثل تحديد هيكل والصعب إزالة التحقيق المتبقية والأجسام المضادة. استخدام رقيقة نسبيا، 5 مم، أقسام الأنسجة يسمح لتصور واضح لهياكل الكلى، في حين تم الإبقاء على إشارة قوية التحقيق في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين ظروف الاعتقال والتحقيق الحضانة لتسهيل التصور والتعبير microRNA مع انخفاض الخلفية وإشارة غير محددة. هنا، يتم وصف بروتوكول الأمثل، الذي يغطي مجموعة الأنسجة الأولية وإعداد من خلال تركيب الشرائح في نهاية الإجراء. وcompone الأساسيةاليلة من هذا البروتوكول يمكن تغييرها لتطبيقها على الأنسجة الأخرى ونماذج ثقافة الخلية.

مجالات قسم الأنسجة التي تصبح جفت خلال التهجين، حضانات أو غسل الخطوات عموما في نهاية المطاف أكثر تلطيخ بحزن خلال تطوير NBT / BCIP. الشكل 1 يبين جزء من قسم الكلى الذي تراجع HybriSlip الخروج من حافة الأنسجة، والسماح لها لتصبح المجففة جزئيا. على الرغم الإماهة والتغطية في الخطوات المتبقية، إشارة في الجزء المجففة مرتفعة بشكل مصطنع. ويتجلى على أهمية السيطرة على الوقت التنمية NBT-BCIP في أرقام 2A...

توضح هذه المقالة في البروتوكول الموقع التهجين الأمثل للكشف colormetric التعبير الرنا الميكروي في الفورمالين أقسام الكلى ثابتة.

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد موقع وقياس كمية تعبير micro RNA داخل أنسجة الكلى. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تهجين مسبار مُوسوم بـ diggen مع micro RNA معين داخل نسيج الكلى. وفي خطوة ثانية، يتم تحضين النسيج مع جسم مضاد لـ digo genin، يكون مقترناً بإنزيم الفوسفاتاز القلوي.بعد ذلك، تُضاف مادة الركيزة N-B-T-B-C-I-P إلى النسيج لتصوير موقع الـ micro RNA من خلال تطوير منتج ذي لون أزرق في مواقع تهجين مجسات الـ micro RNA، وتُستخلص النتائج التي توضح أماكن تعبير الـ microRNAs في مناطق الكلى وقطع النفرون بناءً على تهجين مجسات الـ micro RNA المكملة. يستخدم هذا الإجراء مقاطع كلوية مثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين، والتي يتم تثبيتها على شرائح مجهرية بسماكة 5 microns. ولتحضير مقاطع الكلى للتحليل، ابدأ أولاً بإزالة البارافين من النسيج عن طريق ثلاث غسلات في xylene طازج لمدة 5 دقائق.أعد ترطيب قطاعات الأنسجة عن طريق التحضين لمدة خمس دقائق في تركيزات تنازلية من الإيثانول في ماء مقطر مرتين. بعد ذلك، عالج الشرائح بكمية كافية من dathyl أو percarbonate أو desy لتغطية قطاعات الأنسجة بالكامل لمدة دقيقة واحدة. تأكد من عدم جفاف الأنسجة.أخرج الشرائح من المجفف وقُم بشطفها بـ PBST المعالج بالمجفف مرتين لمدة خمس دقائق. تأكد من جمع المجفف الذي يحتوي على النفايات للتخلص منها بشكل صحيح.من هذه النقطة فصاعداً، يجب معالجة جميع الكواشف لإزالة RNAs؛ أضف proteinase K إلى proteinase K buffer المسخن مسبقاً ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 micrograms per milliliter. غطِّ قطاعات الأنسجة بمحلول proteinase K واتركها في الحاضنة عند 37 degrees Celsius لمدة خمس دقائق. أزل محلول proteinase K بسرعة وأضف 0.2%glycine في PBST لمدة 30 ثانية.اشطف الشرائح في محلول PBST المعالج بـ Desy مرتين لمدة 30 ثانية في كل مرة. وأخيراً، قم بتثبيت قطاعات النسيج في محلول 4% para formaldehyde المحضر حديثاً لمدة 10 دقائق.لبدء هذا الإجراء، أضف 50 µL من محلول التهجين المنظم لكل مقطع نسيجي وقم بتغطيته بشرائح تهجين خالية من الـ RNA تكون أكبر قليلاً من مقاطع الأنسجة. ضع الشرائح داخل غرفة ترطيب تحتوي على مناديل مختبرية مشبعة بـ 50% formamide و 50% 5X SSC. قم بإجراء تهجين مسبق لمقاطع الأنسجة بوضع غرفة الترطيب لمدة ساعتين في فرن عند درجة حرارة التهجين المحددة لمسبار dig oxygen المسمى في الطرف 3'. وعادة ما تكون درجة حرارة التهجين للمسبار هي درجة حرارة انصهار الـ DNA أو TM الخاصة بالمسبار ناقص 21 °C.على سبيل المثال، تبلغ درجة حرارة التهجين للمسبار mere 3 82 ‏54 °C لأن درجة حرارة الانصهار (TM) الخاصة به هي 75 °C. قم بتحضير مسبار micro RNA وعينات الضبط الموجبة والسالبة عن طريق تخفيف كل منها إلى 40 nM في محلول التهجين المنظم. عينة الضبط الموجبة هي U six small nuclear RNA، وعينة الضبط السالبة هي تسلسل عشوائي (scrambled sequence).قم بتسخين المسبار وعينات الضبط عند 65 °C لمدة خمس دقائق. أخرج الشرائح من فرن التهجين. قم بإزالة شرائح التهجين ومحلول التهجين الزائد من إعداد ما قبل التهجين.أضف 75 µL من المسبار المحتوي على المنظم مباشرة فوق كل مقطع نسيجي. غطِّ المقاطع بشرائح تهجين تكون، مرة أخرى، كبيرة بما يكفي فقط لتغطية المقاطع النسيجية، مع الحفاظ على حامل الشرائح في وضع أفقي.أعد الشرائح إلى فرن التهجين عند درجة الحرارة المناسبة. قم بالتحضين طوال الليل لمدة 16 ساعة تقريبًا. بمجرد اكتمال عملية التهجين، أخرج الشرائح من فرن التهجين.أضف 200 µL من محلول two XSSC المسخن إلى درجة حرارة التهجين تحت حافة واحدة من غطاء الشريحة للمساعدة في تحرير الغطاء من النسيج. قم بإزالة غطاء الشريحة عن طريق إمالة الشريحة. بعد إزالة أغطية الشرائح، اغسل الشرائح في 200 µL من محلول 50% formamide و 50% two XSSC عند درجة حرارة التهجين المحددة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة.اشطف الشرائح خمس مرات في محلول PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام هزاز مداري بسرعة منخفضة. ابدأ هذا الإجراء بحضن الشرائح في محلول سد (blocking buffer) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بسرعة منخفضة. بعد مرور ساعة واحدة، أضف 100 µL من شظايا anti dig AP FAB إلى كل مقطع نسيجي وقم بتغطيتها بشرائح هجينة.يتم القص بحجم يكفي فقط لتغطية المقطع. تُحضن الشرائح في غرفة رطبة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل أو لمدة 16 ساعة تقريباً في اليوم التالي. تُغسل الشرائح سبع مرات في محلول PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام هزاز مداري مضبوط على سرعة منخفضة.بعد ذلك، اغسل الشرائح في محلول AP المنظم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بتحضير محلول تطوير N-B-T-B-C-I-P عن طريق إضافة 200 µL من محلول N-B-T-B-C-I-P إلى 10 mL من محلول AP المنظم. أضف من 400 إلى 500 µL من محلول N-B-T-B-C-I-P المخفف إلى كل شريحة لتغطية جميع مقاطع الأنسجة بالكامل.تُترك العينات في غرفة رطبة ومظلمة لمدة تتراوح من أربع إلى خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة حتى يكتمل الكشف اللوني. تُجفف المقاطع في تركيزات متزايدة من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل تركيز، ثم تُنقى المقاطع عبر خمس عمليات حضن في الزايلين لمدة خمس دقائق في كل مرة. وأخيرًا، تُثبّت الشرائح باستخدام وسط التثبيت per mount وتُترك لتجف طوال الليل.يُعد ضمان عدم جفاف مقطع النسيج أمراً بالغ الأهمية لنجاح بروتوكول التهجين الموضعي هذا. يوضح الجزء الأيسر من هذا الشكل جزءاً من مقطع كلوي انزلقت فيه شريحة التهجين عن حافة النسيج، مما أدى إلى تعرضه للجفاف جزئياً. وعلى الرغم من إعادة الترطيب والتغطية في الخطوات المتبقية، إلا أن الإشارة في الجزء المجفف كانت مرتفعة بشكل اصطناعي مقارنة بالجزء الذي ظل مغطى بشريحة التهجين.يمثل شريط المعايرة 100 ميكرون في هذه الصورة. وتوضح الأشكال التالية أهمية تحسين مدة تطوير N-B-T-B-C-I-P. يظهر اللوح A أن فترات التطوير التي تزيد عن أربع إلى خمس ساعات تؤدي إلى ظهور لون غير محدد بشكل واضح وتشتت في الأنسجة التي تم فحصها بمسبار تحكم micro RNA في جميع أنحاء الكلية.يوضح اللوح B أن فترات التحضين التي تزيد عن أربع إلى خمس ساعات لا تؤدي إلى تحسن إضافي في الإشارة عند فحص الكلى بحثاً عن أهداف ذات وفرة عالية مثل ضابط U six small nuclear RNA. وتؤكد هذه الأشكال المقتبسة من دراسة سابقة إمكانية تطبيق طريقة التهجين الموضعي هذه للكشف عن micro RNA في أنسجة الكلى؛ حيث يعرض اللوح A صوراً تمثيلية للتعبير عن mere 3 82 تم الحصول عليها عن طريق التهجين الموضعي في مقاطع كلوية من فئران مصابة أو غير مصابة بانسداد الحالب أحادي الجانب (UUO) والمعالجة إما بـ anti-ME 3 82 أو antis. Scrambled. وقد أدى UUO إلى زيادة التعبير عن mere 3 82 كما يتضح من التلوين الأكثر قتامة في نسيج UUO plus antis scrambled مقارنة بنسيج sham plus antis scrambled.تم تثبيط هذه الزيادة عن طريق المعالجة بـ anti-ME 3 82. وتوضح الرسوم البيانية في اللوحة B تعبير mere 3 82 في الفئران التي خضعت لعملية وهمية بالإضافة إلى المعالجة بـ antis scrambled كنسبة مئوية من متوسط الكثافة الضوئية المتكاملة. وبناءً على قياس كثافة البكسل الملاحظة، فإن UUO يحفز زيادة ملحوظة في تعبير mere 3 82 في النخاع الخارجي والداخلي، بينما يقوم anti-ME 3 82 بتثبيط ذلك.يمكن تصور وقياس هذه الزيادة بالكامل عن طريق التهجين الموضعي للـ micro RNA. وتتوافق هذه النتائج أيضاً مع نتائج Q PCR R غير المعروضة هنا، مما يشير إلى أن استخدام التهجين لـ INI two للكشف عن تعبير mere 3 82 في الكلية المثبتة رسمياً يتسم بحساسية كافية لتقديم نتائج قابلة للقياس تعكس تحليل التعبير القائم على qPCR R. بالإضافة إلى ذلك، يتيح التهجين في C two قياس الاختلافات الإقليمية المتميزة في تعبير micro RNA داخل الكلية.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

هنا ، نحن تصف كفاءة عالية...

إنتاجية عالية في الموقع أسلوب التهجين لتوصيف أنماط التعبير مرنا في الفأر الجنينية السفلى المسالك البولي التناسلي

نصف هنا بروتوكولا مبسطا لتحليلات تعبير microRNA (miRNA) في الأنسجة السريرية المؤرشفة الثابتة بالفورمالين ، المضمنة في البارافين (FFPE) أو سرطان البروستاتا المجمد الطازج (PCa) التي تستخدم PCR الكمي في الوقت الفعلي (RT-PCR) والتهجين في الموقع (ISH).

ميرنا تحليلات التعبير في سرطان البروستاتا الأنسجة السريرية

نقدم هنا بروتوكولا للكشف عن تعبير miRNA في عينات مرضى سرطان الثدي باستخدام miRNA في التهجين...

تحليل إكلينيكية من ميرنا التعبير في سرطان الثدي الأنسجة باستخدام ميرنا<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.

تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي الصغير في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الحادة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي في الوقت الفعلي. يؤكد هذا البروتوكول على نموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية والاستخراج الدقيق لعينات الحمض النووي الريبي الدقيق.

طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

نحن وصف طريقة لتقييم التعبير ميكرورنا في الكلى من الفئران مع انسداد الحالب الأحادي (UUO) عن طريق تفاعل البوليميراز سلسلة النسخ العكسي الكمية. هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة ملامح التعبير ميكرورنا الكلي في الفئران مع UUO وفي سياق الحالات المرضية الأخرى.

الكمية في الوقت الحقيقي PCR التقييم من التعبيرات ميكرورنا في الكلى الماوس مع انسداد الحالب أحادي

وتشارك microRNAs في التسبب في اعتلال الكلية IgA. لقد طورنا طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). ستسهل هذه الطريقة الجديدة التحقق من تورط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.

الكشف عن تعبير MicroRNA في كليتي الغلوبولين المناعي A الفئران الكلوية

هنا ، نقدم محاكاة miRNA الخارجية المركبة صناعيا إلى الكلى عن طريق حقن الوريد الخلفي لناقل غير فيروسي وجسيمات نانوية بولي إيثيلينيمين في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى. أدى ذلك إلى إفراط كبير في التعبير عن miRNA المستهدف في الكلى ، مما أدى إلى تثبيط تطور مرض الكلى في العديد من نماذج الفئران.

توصيل miRNA الخارجي المركب صناعيا إلى الكلى باستخدام جسيمات البولي إيثيلينيمين النانوية في العديد من نماذج الفئران لأمراض الكلى

يصف البروتوكول مقايسة تهجين التألق المناعي الترادفي مع الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي الصغير والبروتينات متعددة الإرسال في وقت واحد.

تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي

تعلم تقنية التهجين الموضعي لتحديد وتقدير التعبير عن الرنا الميكروي في أنسجة الكلى الثابتة بالفورمالين. تُظهر الطريقة توزيع الرنا الميكروي في أجزاء الكلى المختلفة باستخدام مسبار مُوسوم بالديجوكسيجينين.

الرنا الميكروي

استكشف المزيد من الفيديوهات