زراعة وصيانة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل بكتيريا c difficile من عينات البراز لاستزراع C difficile من أجل تحضير مخزونات الجلسرين للتخزين طويل الأمد، وتحضير وتعداد مخزونات الأبواغ لمجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل C difficile من عينات البراز من خلال الزراعة على وسط انتقائي. وتتمثل الخطوة الثانية في تنمية C difficile في وسط سائل والحفاظ على مخزونات C difficile لفترات طويلة في الجلسرين.

بعد ذلك، يتم استعادة C difficile من مخزونات الجلسرول المجمدة وتخطيطها على أطباق الآجار. وفي الخطوة النهائية، يتم تحضير مخزونات أبواغ C Difficile وتعدادها في نهاية المطاف باتباع هذه البروتوكولات. يمكن تنمية C difficile على أوساط زراعية متنوعة للتحقق من هويتها وتأكيدها، ولضمان استزراعها والحفاظ عليها بنجاح.

يمكن استخدام هذه السلالات والمزارع المحفوظة في الجلسرول لاحقاً في العديد من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك الدراسات الحيوانية ودراسات البيولوجيا الجزيئية الإضافية. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام غرفة لاهوائية من الفينيل لاستزراع c difficile مقارنة بالطرق الأخرى مثل استخدام أواني الشموع، في إمكانية الحفاظ على بيئة لاهوائية صارمة، مما يسمح بنمو متسق وموثوق لبكتيريا c difficile. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنيات بعض المشكلات بسبب نقص البراعة في الحركة داخل الغرفة نتيجة ارتداء القفازات، وكذلك بسبب الحاجة الماسة للتخطيط لتجاربهم مسبقاً.

سيقوم الفني من مختبري، Jose Suarez، بتوضيح هذه الإجراءات في البداية. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في ظروف هوائية. أولاً، يتم وزن عينة البراز.

يعد هذا الإجراء ضرورياً لتعداد بكتيريا c difficile من البراز. بعد ذلك، أعد تعليق عينة البراز في XPBS واحد واستخدم جهاز vortex لضمان إعادة تعليق عينة البراز بالكامل. تالياً، قم بإجراء تخفيفات متسلسلة لعينة البراز المعاد تعليقها في XPBS واحد من أجل العزل المناسب أو تعداد الوحدات المكونة للمستعمرات أو CFU لكل جرام من البراز من هذه النقطة فصاعداً.

أجرِ العملية في ظروف لاهوائية لضمان عدم تعرض الخلايا الخضرية لبكتيريا C difficile لأي أكسجين. يتم الحفاظ على الغرفة اللاهوائية المستخدمة في هذه التجربة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. باستخدام تقنية التعقيم.

ضع 100 µL من كل تخفيف تسلسلي على أطباق Toro collate oxetane، أو cyclo Seine، أو fructose agar، أو T-C-C-F-A. وقد تم تقليل هذه الأطباق مسبقاً لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين على الأقل في الغرفة اللاهوائية لضمان إزالة الأكسجين المتبقي، وذلك لعزل المستعمرات من أجل التعداد الدقيق أو لتطبيقات لاحقة أخرى.

استخدم عروة تلقيح معقمة لتوزيع المزرعة المضافة بالتساوي على سطح طبق T-C-C-F-A. حضن الأطباق لاهوائياً لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد مرور 48 ساعة، حدد مستعمرات c difficile بناءً على مظهرها المسطح وغير المنتظم الشبيه بالزجاج المصنفر، وذلك لضمان عدم موت الخلايا الخضرية لـ c difficile نتيجة التعرض للأكسجين.

يجب الاحتفاظ بالأطباق المستخدمة لعزل المستعمرات للتطبيقات اللاحقة داخل الغرفة اللاهوائية في جميع الأوقات. أما بالنسبة لتعداد المستعمرات، فيمكن إخراج الأطباق من الغرفة اللاهوائية. يرجى ملاحظة أنه بمجرد إخراج الطبق من الغرفة، ستتعرض الخلايا الخضرية لبكتيريا c difficile للأكسجين وستموت.

لا يمكن استعادة مستعمرات C difficile هذه حتى لو تمت إعادة الطبق إلى الحجرة. قم بعدّ مستعمرات C difficile لكل تخفيف واحسب عدد CFU لكل جرام من عينة البراز لزراعتها وتحضير مخزونات جليسرول من C difficile. استخدم عروة تلقيح معقمة لالتقاط مستعمرة فردية وتخطيطها على وسط Brain Heart Infusion مختزل مسبقاً.

على طبق آجار BHIS مضاف إليه مستخلص الخميرة، ومُدعم بـ 0.03% cysteine، يتم تخطيط المستعمرات الفردية والأرباع باستخدام حلقة تلقيح معقمة جديدة لكل ربع. تُحضن الأطباق لاهوائياً عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. وبمجرد ظهور مستعمرات منعزلة على أطباق آجار BHIS، يتم اختيار مستعمرة منعزلة واحدة وإعادة تعليقها في 10 milliliters من وسط BHIS السائل المختزل مسبقاً، والمُدعم بـ 0.03% L cysteine، ثم تُحضن طوال الليل.

بشكل لاهوائي عند 37 درجة مئوية أو حتى تصبح المزرعة عكرة. في اليوم التالي، يتم إضافة 333 µL من glycerol بتركيز 50% و 666 µL من مزرعة c difficile إلى أنبوب تجميد سعة 1.8 mL. ولإنشاء مخزون glycerol بتركيز 15% من السلالة المعزولة، يتم إغلاق أنبوب التجميد بإحكام والمزج.

قم بإزالة المخزون فوراً من الغرفة اللاهوائية وضعه في مجمد بدرجة حرارة 80- درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. لبدء هذا الإجراء، قم بإزالة مخزون الجلسرول المجمد من بكتيريا c difficile من المجمد بدرجة حرارة 80- درجة مئوية، وذلك لمنع الذوبان.

ضع مخزون الجلسرول المجمد فوراً في رف تبريد تم تخزينه عند درجة حرارة 80- درجة مئوية قبل الاستخدام. انقل مخزون الجلسرول المجمد الموجود في رف التبريد إلى الغرفة اللاهوائية باستخدام تقنية التعقيم وعروة تلقيح معقمة. ضع كمية صغيرة من المخزون على الطبق وقم بالتخطيط عبر ربع واحد من الطبق.

قم بتدوير الطبق بمقدار 90 درجة، وباستخدام عروة تلقيح معقمة جديدة، قم بالتخطيط عبر الربع الثاني. كرر هذه العملية للربعين الثالث والرابع لضمان عزل المستعمرات الفردية. قم بإخراج مخزون الجلسرول المجمد فوراً من الغرفة اللاهوائية وأعده إلى المجمد عند درجة حرارة 80- درجة مئوية.

قم بتحضين الطبق لاهوائيًا طوال الليل عند 37 درجة مئوية لتنقية الأبواغ من مزرعة c difficile. يتم نقل السلالات من المخزون الجليسري المجمد إلى أطباق BHIS المختزلة مسبقًا، وذلك باتباع الإجراء الموضح في الجزء السابق.

قم بالتحضين لاهوائيًا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، قم بتنقيط المستعمرات الفردية في عدة أطباق pred reduced 70 30. ثم حضنها لاهوائيًا عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة.

بمجرد تشكّل الأبواغ، قم بإخراج الأطباق من الغرفة اللاهوائية. اكشط الأطباق باستخدام عروة تلقيح معقمة وأعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من محلول 1 XPBS المعقم. تخلص من الأطباق، ثم قم بترسيب الخلايا عند 3000 G لمدة 15 minutes.

قم بإزالة الطافي، وأضف 1 mL من محلول 1 XPBS لإعادة التعليق، ثم قم بالتعليق والترسيب مرة أخرى بهذه الطريقة. اغسل الخلايا مرتين في PBS واحضنها عند 4 °C طوال الليل للمساعدة في تحلل الخلايا الخضرية والخلايا الأم في اليوم التالي، ثم احضنها عند 70 °C لمدة 20 دقيقة لقتل أي خلايا خضرية متبقية. ولتحديد CFU لكل مليلتر، قم بتخفيف كل تحضير للأبواغ تسلسلياً في 1 XPBS وزعها في أطباق BHIS المختزلة مسبقاً مضافاً إليها 0.1% Sodium Toro collate، واحضن الأطباق عند 37 °C لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل تعداد المستعمرات.

يمكن تخزين الأبواغ في محلول XPBS واحد، إما في درجة حرارة الغرفة للتخزين قصير المدى أو في درجة حرارة 4 °C للتخزين طويل المدى. أ. يمكن رؤية مثال على نمو بكتيريا c difficile على وسط BHIS وأطباق أغار دم الغنم اللاهوائية من كولومبيا هنا.

تُشكل بكتيريا C difficile مستعمرات غير منتظمة تكون مسطحة وتمتلك مظهراً يشبه الزجاج المطحون يظهر بوضوح على كلا الوسطين. يوضح اللوح A عزلة سريرية من C difficile 630 E الحساسة للإريثروميسين، نمت على أغار BHIS، وهو وسط غني غير انتقائي لمدة 24 ساعة. وعند درجة حرارة 37 درجة مئوية، تظهر المستعمرات على أغار دم الغنم اللاهوائي من كولومبيا الموضح في اللوح B بشكل مشابه للمستعمرات التي نمت على BHIS تحت الضوء الأبيض.

ومع ذلك، فإن استخدام هذا الوسط يتيح أيضاً الكشف عن الفلورة المائلة للخضرة أو اللون الحمضياتي التي تظهرها بكتيريا C difficile تحت الأشعة فوق البنفسجية ذات الموجة الطويلة الموضحة في اللوحة C بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل منحنيات النمو في الوسط السائل، واستخلاص DNA و RNA، وعزل المستعمرات، وتفاعل PCR وغيرها من تقنيات البيولوجيا الجزيئية والمعالجات المناسبة لبكتيريا C difficile، بالإضافة إلى استخدام أبواغ C difficile في الدراسات الحيوانية، وذلك للإجابة على تساؤلات إضافية في البيولوجيا الجزيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل واستزراع والحفاظ على الخلايا الخضرية وأبواغ C difficile ضمن بيئة لاهوائية.

لا تنسَ أن بكتيريا c difficile هي ممرض بشري وحيواني يمكن أن يسبب أمراضاً في الجهاز الهضمي. يجب إجراء التجارب التي تتضمن c difficile تحت ظروف مستوى السلامة البيولوجية الثاني المناسبة.