دراسة تفاعلات المكورات العنقودية الذهبية مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة تأثيرات الفينول بالمكورات العنقودية أو المودلين القابل للذوبان أو PSMs على العدلات البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل العدلات أولا عن دم الإنسان لتحليله في المختبر لاحقا. بعد ذلك ، يتم تحميل العدلات إما بصبغة الفلورسنت وخلطها بسلسلة تركيز من PSMs مع وبدون مثبطات ، أو يسمح لها ببكتيريا البلعمة S reus التي تحتوي على بناء مراسل GFP المحفز PSM ألفا.

في نهاية المطاف ، يمكن مراقبة تنشيط العدلات عن طريق تحفيز PSM عن طريق قياس التدفق الخلوي والتعبير عن GFP بواسطة البلعمة. يمكن تحليل البكتيريا عن طريق المجهر الفلوري بهذه الطريقة. يمكنك دراسة تأثيرات المكورات العنقودية أو الفينيل أو فول الصويا أو المولين أو العدلات.

بالطبع ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الخلايا الأخرى والمنبهات والخصم. خطرت لنا لأول مرة فكرة جزء الفحص المجهري من هذه الطريقة عند مناقشة طريقة لمراقبة تأثيرات PSMs داخل العدلات. يتيح لنا استخدام بناء تعبير GFP البكتيري والفحص المجهري بفاصل زمني القيام بذلك بالضبط.

بعد سحب خمسة أنابيب من الدم الوريدي الهيباريني ، اسكب 12 ملليلترا من محلول فيال بكثافة 1.119 جرام لكل مليلتر في أنبوب سعة 50 مليلتر ، ثم قم بتراكب 10 ملليلتر بعناية من محلول استدعاء FI بكثافة 1.077 جرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف الدم بحجم متساو من PBS وطبقة 20 إلى 25 مل من الدم بعناية على كل طبقة مزدوجة من تدرج الاتصال. الطرد المركزي التدرجات لمدة 20 دقيقة عند 396 مرة G و 22 درجة مئوية دون كسر.

ثم استخدم مضخة تفريغ مزودة بطرف ماصة معقم لشفط طبقات البلازما الصفراء العلوية وطبقات PBMC. ثم الطبقة البيضاء الثالثة. استخدم الآن ماصة بلاستيكية صغيرة لنقل العدلات متعددة الأشكال أو جزء PMN من كل أنبوب إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا.

أضف PMI المحضر حديثا مسبقا المكمل بألبومين مصل بشري أو R-P-M-I-H-S-A إلى كل أنبوب ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ملليلترا. ثم قم بتدوير الخلايا ، وشفط المادة الطافية بمضخة تفريغ وقم بدوامة كريات الدم الحمراء الحمراء والحبيبات المحتوية على PMN برفق. بعد ذلك ، أضف تسعة ملليلتر من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى الخلايا وابدأ جهاز توقيت.

أضف 30 ثانية بالضبط. أضف ملليلتر واحد من PBS المركز 10 مرات لوقف الصدمة فرط التناضح. ثم اغسل الخلايا بحجم إجمالي قدره 50 مل من R-P-M-I-H-S-A.

بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من R-P-M-I-H-S-A إلى كل حنك ، والذي أصبح الآن أبيض بسبب تحلل كريات الدم الحمراء. ثم إعادة التدوير ، قم بتعليقها عن طريق سحب العينات وامزج الكريات في أنبوب واحد. الآن عد الخلايا واضبط التركيز على واحد في 10 للخلايا السابعة لكل مليلتر.

الآن قم بتحميل خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر مع اثنين من الإنفلونزا الدقيقة أوه 3:00 صباحا في R-P-M-I-H-S-A. وقم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة تحت التحريض.

في غضون ذلك ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي ثلاثي الأبعاد للمحفز بمعدل 10 أضعاف التركيز النهائي. ثم قم باحتضان 30 ميكرولترا من المنبه مسبقا بحجم متساو من المثبط أو المخزن المؤقت المحضر حديثا 10 مرات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من R-P-M-I-H-S-A وأعد تعليق الخلايا في R-P-M-I-H-S-A الطازج بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

قبل تحليل التدفق مباشرة ، قم بتخفيف الخلايا إلى مرتين في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في R-P-M-I-H-S-A وأضف 200 ميكرولتر من الخلايا لكل أنبوب فاكس. الحرص على عدم تنشيط الخلايا عن طريق الاهتزاز أو سحب العينات ، قم بتحميل الأنبوب الأول على مقياس التدفق الخلوي. انتظر ثلاث ثوان ثم ابدأ الاستحواذ بعد فترة زمنية محددة ، على سبيل المثال ، ثماني ثوان ، انزع الأنبوب وأضف بسرعة 50 ميكرولترا من أقل تخفيف للحافز إلى العينة.

أعد تحميل الأنبوب على الفور واستمر في الاستحواذ. عند الانتهاء من سلسلة التخفيف ، اغسل إبرة مقياس التدفق الخلوي باستخدام R-P-M-I-H-S-A الطازج قبل قياس سلسلة جديدة. بعد تشغيل العينة الأخيرة ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي لتحليل تعبير GFP البكتيري.

بعد نمو البلعمة PMN سلالة S ous تحتوي على بناء المراسل ذي الأهمية بين عشية وضحاها في المرق ، قم بإزالة أي GFP يتم التعبير عنه أثناء الثقافة الليلية عن طريق تخفيف الخلايا إلى OD 6 60 0 0.01. قم بتنمية الثقافة إلى OD 6 60 0 0.1. خفف الخلايا من واحد إلى 30 ، ثم راقب النمو حتى تصل الثقافة مرة أخرى إلى OD ستة 60 من 0.1.

ثم جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. اغسل الخلايا مرة واحدة في DPBS و Resus. الثقافة.

أضف واحدا إلى 10 من الحجم الأصلي للحصول على OD ستة 60 من 1.0 أو ما يقرب من خمسة أضعاف 10 إلى CFU الثامن لكل مليلتر. الآن امزج البكتيريا مع PNS المعزولة حديثا في R-P-M-I-H-S-A بنسبة 10 إلى واحدة. ثم أضف مصل بشري مجمعة إلى واحد 10 من الحجم النهائي الكلي للمصل البشري المجمعة داخل محلول الخلية.

تحفيز البلعمة عن طريق رج خليط الخلية لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتخفيف البكتيريا PMNs المحملة إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر ، ونقل 250 ميكرولترا من الخلايا إلى كل بئر من زلة غطاء من ثماني غرف جيدة. أخيرا ، قم بتصوير الخلايا على مجهر مقلوب مجهز بهدف 40 × ومغلف في غرفة بيئة مظلمة واحصل على صور في مواقع متعددة في غرف انزلاق الغطاء كل خمس إلى 10 دقائق في كل من المجال الساطع وقناة GFP لمتابعة إنتاج GFP البكتيري في الوقت الفعلي ، واحتضان العدلات بسلسلة تركيز من PSM الاصطناعية ألفا ثلاثة ينتج عنه تنشيط سريع يعتمد على الجرعة ل الخلايا كما تم قياسها بواسطة تدفق الكالسيوم.

ما قبل الحضانة من PSM ألفا ثلاثة الببتيد مع 0.01٪ 0.1٪ أو 1٪ المصل البشري يثبط بشكل كبير قدرة الحافز على استنباط استجابة الكالسيوم. مرة أخرى بطريقة تعتمد على جرعة عند 1٪ مصل. بالكاد يكون أي تنشيط مرئيا في تركيزات PSM ألفا الثلاثة.

في هذه الصور ، يتم عرض اثنين من العدلات التي تحتوي على بكتيريا البلعمة التي تحتوي على بنية مراسل PSM alpha GFP. تبدأ البكتيريا في التألق بعد حوالي ساعة من البلعمة مما يشير إلى التعبير عن GFP من مروج PSM Alpha. لا تتألق البكتيريا الموجودة خارج العدلات مما يشير إلى أن تعبير PSM alpha يتم تشغيله بسرعة فقط عندما تكون البكتيريا بلعمة.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما استخدام العدلات الطازجة للحصول على أفضل النتائج. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، أتمنى أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تدفق الكالسيوم عن طريق قياس التدفق الخلوي وكيفية قياس التعبير الجيني البكتيري داخل الخلايا حقيقية النواة باستخدام المجهر الفلوري.