التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المتزامن وتصوير الكالسيوم للخلايا العصبية للنواة فوق الوظيفية

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص التفاعل بين التغيرات في الجهد أو التيار ، مثل التغيرات في العمل ، وتردد إطلاق النار المحتمل ، وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية للنواة فوق الماتيكية. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شريحة الدماغ لتسجيل الخلايا العصبية لنواة SMA باستخدام قطب كهربائي صغير مملوء بمسبار حساس للكالسيوم. كخطوة ثانية ، يتم إغلاق القطب الصغير بالغشاء العصبي.

بعد ذلك ، يتم تمزق الغشاء العصبي المختوم بالقطب الصغير لإدخال مسبار فلورسنت الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية وللتسجيل جنبا إلى جنب مع نتائج النشاط الكهربائي للغشاء التي تظهر قياسات الجهد أو التيار وصور تألق مسبار الكالسيوم بطولين موجيين يعكس التغيير في نسبة التألق عند هذه الأطوال الموجية تغير الكالسيوم داخل الخلايا العصبية. يمكن إجراء التحليل اللاحق لتحديد تركيز الكالسيوم في الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التغيرات في النشاط الكهربائي للغشاء والكالسيوم داخل الخلايا الناتجة عن التنشيط المشبكي يمكن قياسها في وقت واحد في الخلايا العصبية النواة التجميلية الفردية.

سيظهر هذه التقنية زميلي الدكتور روبرت إيروين. ابدأ هذا الإجراء بوضع دماغ الفئران على ورق ترشيح دائري مبلل بمحلول تقطيع على طبق بتري زجاجي ، ويستريح على الثلج ، ويقطع هالة الدماغ فقط لإزالة المخيخ وجذع الدماغ ، وقطع أجزاء من الجانبين الأيمن والأيسر من القشرة ، تاركا كتلة من الدماغ تحتوي على منطقة ما تحت المهاد والحفاظ بعناية على الجانب البطني من الدماغ الذي يحتوي على الأعصاب البصرية SCN والتصلب البصري. بعد ذلك ، انشر طبقة رقيقة من غراء الأكريليك سانو ، كبيرة بما يكفي لربط الدماغ وتكوين كتل في غرفة تقطيع ميكروتوم مثلجة.

انقل كتلة الدماغ المثلجة المثلجة لأسفل على الغراء مع وضع الجانب الذي يحتوي على SCN للقطع أولا وتشكل الأعصاب البصرية على شكل حرف V يشير إلى أعلى ضع كتل aros على ثلاثة جوانب أخرى. بعد ذلك ، املأ الغرفة بمخزن مؤقت للتقطيع المثلج ، واجعل الفقاعات باستمرار بالكربوجين. سوف يتجمد غراء الأكريليك سانو مع الرطوبة ويحافظ على الدماغ ويتسبب في الكتل في مكانها.

ثم قطع شرائح ما تحت المهاد الإكليلية التي تحتوي على SCN بسمك 220 إلى 250 ميكرون. لاحظ أن كتلة aros اليسرى منفصلة أثناء القطع. يمكن أن يحدث هذا إذا تم تطبيق غراء غير كاف.

بعد ذلك ، حدد الشريحة التي تحتوي على SCN. عادة ، يتم اختيار شريحة حيث يبلغ عرض التصاب البصري حوالي ملليمترين إلى أربعة ملليمترات ويظهر مثل شريط أبيض مع ظهور SCN الظهري فقط كفجوتين صغيرتين في chiasm البصري على جانبي البطين الثالث. انقل شريحة إلى غرفة التسجيل 36 درجة مئوية المثبتة على منصة المجهر.

تمتلئ الغرفة بمحلول تسجيل متدفق باستمرار بملليلتر في الدقيقة. تهوية بنسبة 95٪ كربوجين ومسخنة مسبقا بسخان مضمن. حدد SCN من خلال مراقبة نواتين SCN الشفافتين على جانبي البطين الثالث ، الظهرية إلى chiasm البصرية التي تظهر مثل شريط أسود عند إضاءتها بالضوء المنقول.

لتحضير القطب الصغير للتسجيل ، قم بإعادة تعبئته بالمحلول الداخلي الذي يحتوي على مسبار الكالسيوم الذي تمت ترشيحه بمرشح حقنة بأربعة ملليمترات عبر أنبوب ملء دقيق. ثم ضع القطب الصغير في حامل القطب الكهربائي الصغير. بعد ذلك ، قم بتطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي المستمر على القطب.

اخفض القطب الصغير في غرفة التسجيل بتوجيه من إضاءة الضوء الأحمر. ثم ضع القطب الصغير فوق SCN باستخدام هدف منخفض الطاقة. بعد ذلك ، قم بتبديل المجهر إلى تكبير عالي الطاقة لتحديد منطقة فرعية من SCN وخلية عصبية SCN فردية.

استمر في الضغط الإيجابي اللطيف على القطب الصغير أثناء تقدمه على سطح الخلية. بمجرد أن يصبح على السطح ، استخدم ضغطا سلبيا لطيفا لتشكيل ختم بمقاومة من ثلاثة إلى 10 جيجا أوم. بعد ذلك ، اضبط جهد الغشاء على 60 مللي فولت تحت الصفر.

ثم قم بتطبيق ضغط سلبي إضافي على القطب لتمزيق غشاء الخلية من أجل تشكيل لقط رقعة الخلية بالكامل. عند الدخول إلى وضع الخلية بأكمله ، سيتم ملء سوما الخلايا العصبية SCN والتشعبات بمسبار الفلورسنت. قم بقياس جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي أو التيار في وضع مشبك الجهد.

أثناء مراقبة بيانات صورة مسبار الكالسيوم وتخزينها ، يمكن عرض الصور المكتسبة جنبا إلى جنب مع رسم بياني لبيانات مضان بنسبة 340 نانومتر و 380 نانومتر. أثناء التجربة ، يتم استخدام كرونومتر أحادي للحصول على قياسات الكالسيوم كميا عن طريق تعريض SCN بسرعة للأشعة فوق البنفسجية. عند 340 نانومتر و 380 نانومتر ، يمر ضوء الإثارة عبر مرشح بصري UG 11 لتقييد الأطوال الموجية التوافقية فوق 400 نانومتر وتعكس مرآة DCLP ثنائية اللون 400 نانومتر الضوء على الأنسجة.

يمر الضوء المنبعث عبر مرشح انبعاث 510 نانومتر ويتم التقاطه بواسطة الكاميرا. لتحليل النتيجة، حدد منطقة اهتمام من الصورة الأولية ومنطقة خلفية ليتم تحويلها إلى وحدات شدة مضان نسبية. تظهر بيانات منطقة الاهتمام في الوقت الفعلي أثناء التجربة.

يتم استخدام الخلفية لاحقا في تحليل البيانات اللاحق. فيما يلي صورة ميدانية ساطعة لشريحة إكليلية من منطقة ما تحت المهاد تحتوي على SCN والتصلب البصري. يتم إغلاق قطب كهربائي زجاجي صغير مملوء بمحلول داخلي يحتوي على بسراء اثنين على خلية عصبية واحدة.

تظهر هنا استجابات الكالسيوم لسلسلة من 50 خطوة جهد مسجلة من الخلايا العصبية SCN المثبتة بالجهد. تم تثبيط تيارات الصوديوم ذات الجهد المسور ب 0.5 ميكرومولار TTX ، وهذه صورة لالتقاط الشاشة للمناطق الجسدية والتغصنية ذات الأهمية المقابلة لاستجابات الكالسيوم. هذه أمثلة على استجابات الكالسيوم لعدد متغير من خطوات الجهد.

يوضح هذا الشكل التسجيل المتزامن لجهد الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا. في الخلايا العصبية SCN ، تم إجراء تجربة المشبك الحالية في وجود 50 ريتوكسين ميكرومولار. أدى إزالة الاستقطاب الصغيرة لإمكانات الغشاء إلى عدة نوبات من العمل ، وإطلاق محتمل مع ارتفاع مماثل وانخفاض لاحق للكالسيوم داخل الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح دماغ نواة مستحضرات التجميل الصحية ، وإجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير المتزامنة. لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الحماية المناسبة للعين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.