التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة أحداث الميتوكوندريا المفردة مثل ومضات الأكسيد الفائق والتقلبات المحتملة للغشاء في الموقع أو في الجسم الحي لتحقيق تقييم في الوقت الفعلي لوظيفة الميتوكوندريا في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض العضلة الهيكلية في الطرف الخلفي للفأر أولا. يتم الحصول على الصور البؤرية بفاصل زمني التالي لعضلات الهيكل العظمي في الجسم الحي.

ثم يتم نفخ قلب الفأر وتصويره باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. أخيرا ، تتم معالجة الصور وتحليل البيانات. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر ومضات فائقة أكسيد الميتوكوندريا المفردة وتقلبات محتملة الغشاء في عضلات الهيكل العظمي ، في الجسم الحي ، أو في القلب المنفوخ من خلال الصور ذات الفاصل الزمني والصور ثنائية البؤر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على العضلات الموجودة مثل تقييم وظيفة الميتوكوندريا في عزل الميتوكوندريا هي أن هذه التقنية تسمح بالتقييم في الوقت الفعلي لوظيفة الميتوكوندريا المفردة في حالة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. نحن نعرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم التصوير متحد البؤر للسكين أو أو السكين لأنه إجراء أكثر حدة وتعقيدا. بعد تحضير محلول الملح المتوازن متساوي التوتر أو IBSS ، يقوم Krebs HENSEL Light Buffer أو KHB والأدوات الجراحية وفقا لبروتوكول النص بتخدير الفأر بحقن Pentobarbital داخل الصفاق وإجراء قرصة إصبع القدم للتأكد من أن مخدر.

باستخدام ماكينة حلاقة ، قم بإزالة الشعر من أحد الأطراف الخلفية قبل تطهير الموقع بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بعمل شق على الجلد على طول الجانب الخارجي من الطرف لفضح عضلات فقر الدم المعدي. ثم باستخدام ملقط حاد ، التقط epimysium برفق واستخدم المقص لعمل شق من خلاله.

مزيد من التشريح لإزالة epimysium وفضح ألياف العضلات تحته. أضف 500 نانو إيثيل رباعي إيثيل أو قضيب دومين ميثيل إستر أو TMRM إلى القولون العصبي واغمر العضلات في المحلول لمدة 30 دقيقة. بعد تحميل TMRM في العضلات, اغسل العضلات باستخدام TMRM IBSS الحرة باستخدام 40 × هدف الزيت.

ضع الماوس على جانبه على مرحلة المجهر متحد البؤر وقم بتقييد الطرف الخلفي بحيث تكون عضلة الهيكل العظمي المكشوفة في غرفة مخصصة ضد زلة الغطاء. ثم اضغط برفق على الساق لإجراء اتصال محكم بين الأنسجة والغطاء ، وانزلق واغمر العضلات المكشوفة في القولون العصبي ، باستخدام عمق بكسل ثمانية بت ومعدل أخذ عينات يبلغ ثانية واحدة لكل إطار ، وتسجيل مسح تسلسلي ثنائي الأبعاد للعضلة. اجمع الصور المتسلسلة من خلال الإثارة أولا عند 405 نانومتر وجمعها بأكثر من 505 نانومتر.

ثم مثيرة عند 488 نانومتر أثناء التجميع عند أكثر من 505 نانومتر. لإثارة الطول الموجي المزدوج ل MT. CCP YFP ، استخدم الإثارة المتسلسلة عند 405 488 و 543 نانومتر وجمع الانبعاثات عند 505 إلى 5 45.505 إلى 5 45 وأكبر من 560 نانومتر على التوالي. لتصوير الإثارة ثلاثي الطول الموجي ل M-T-C-P-Y-F-P و TMRM لتصوير قلب الفأر ، قم بحقن ب 200 وحدة من الهيبارين.

بعد الانتظار 10 دقائق والقتل الرحيم للفأر عن طريق بضع الصدر ، قم بإزالة القلب والرئتين والغدة الصعترية المرتبطة به بسرعة. انقل الأنسجة المزروعة بسرعة إلى القولون العصبي المثلج البارد. ثم حدد فصوص الغدة الصعترية وقشرها برفق مرة أخرى.

لكشف الشريان الأورطي الصاعد ، قم بإزالة الرئة والغدة الصعترية وعزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي أنسجة محيطة بعناية. بعد ذلك ، قم بعمل قطع في الطرف العلوي من الشريان الأورطي الصاعد قبل الفرع الأول من قوس الأبهر. ثم باستخدام ملقطين للخياطة الدقيقة ، أمسك جدار الشريان الأورطي برفق لكشف التجويف وضعه بعناية على قنية.

استخدم مشبك الأوعية الدقيقة لتثبيت الشريان الأورطي في مكانه وربط الغرز حوله بسرعة. قم بإزالة المشبك واستخدم الملقط للتحقق بعناية من أن طرف القنية فوق جذر الأبهر. قم بتأمين أربطة إضافية إذا لزم الأمر لتثبيت القلب في مكانه.

قم بتشغيل المضخة التمعجية وقم ببث القلب. بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة ، سيستأنف القلب النبض عند التروية. بعد 10 دقائق من الاستقرار ، قم ببث القلب ب 10 ميكرومولار BLEs ستاتين و 100 إلى 500 نانومولار TMRM.

سوف تتباطأ ضربات القلب بعد 10 دقائق. بعد ذلك ، اضبط موضع نظام التروية وضع القلب على مرحلة المجهر المزود بمحول لتسخين الغرفة إلى 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر واحد من محلول التروية KHB في الحجرة لغمر القلب جزئيا.

استخدم مضخة تمعجية لإزالة النفايات السائلة من الغرفة. زيادة سرعة المضخة تدريجيا لتوفير تدفق كاف للقلب لضمان ملامسة القلب بإحكام مع زلة الغطاء ولزيادة قمع ضربات القلب ، قم بالضغط برفق على القلب. قم بتصوير العضو كما هو موضح للعضلة في وقت سابق من هذا الفيديو ، واضبط المستوى البؤري للكشف عن أوضح صورة ممكنة.

باستخدام وحدة التحليل الفسيولوجي لبرنامج المجهر متحد البؤر. ابدأ بفتح قاعدة البيانات التي تم إنشاؤها تلقائيا ثم ملف الصورة ثنائي الأبعاد المراد تحليله. انقر فوق منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار.

للتبديل إلى متوسط وضع عائد الاستثمار. قم بإيقاف تشغيل عرض القنوات باستثناء CP YFP عند 488 نانومتر لتحديد الومضات. قم بتكبير الصورة وحرك شريط الشرائح يدويا لتشغيل الصور ثنائية الأبعاد التسلسلية.

بعد ذلك ، حدد ومضات أكسيد الميتوكوندريا الفائق المفردة عن طريق تحديد الموقع الذي تزداد فيه إشارة الفلورسنت بشكل عابر. استخدم أداة عائد الاستثمار المناسبة لتمييز الومضات ، وسيظهر التتبع الذي يظهر تغيير التألق المعتمد على الوقت لكل عائد استثمار بجانب الصورة. بعد تحديد جميع الومضات ، قم بتشغيل عرض القنوات الأخرى.

حدد عائد استثمار على الصورة خارج الخلية لطرح إشارة الخلفية. ثم قم بإخراج متوسط التألق لكل عائد استثمار مع ملصقات الوقت. سجل عدد الومضات في كل ملف من ملفات صور المسح التسلسلي مع وقت المسح ومساحة الخلية.

استخدم Excel لحساب تردد الفلاش كعدد من الومضات لكل 100 ثانية ولكل مساحة خلية 1000 ميكرون مربع. لحساب وقت السعة إلى الذروة ووقت الاضمحلال لكل وميض. استخدم برنامجا مقدما مخصصا لتحليل معلمات الفلاش وهو جزء من برنامج مطور مخصص مكتوب بلغة البيانات التفاعلية.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إجراء التصوير في الجسم الحي لأحداث الميتوكوندريا المفردة في عضلات الهيكل العظمي للفئران المخدرة ، متبوعا بالتصوير insi في القلب المنفخ. كما هو موضح هنا. غالبا ما يستخدم TMRM ، وهو مؤشر محتمل لغشاء الميتوكوندريا ، للتحقق من موقع M-T-C-P-Y-F-P ويجب أن يظهر نمطا متداخلا كاملا مع إشارة M-T-C-P-Y-F-P.

تمييز أطيافها عن طياف CP YFP ، وباستخدام طريقة الإثارة المتسلسلة ، لن تتداخل إشارات الانبعاث ل TMRM و M-T-C-P-Y-F-P مع بعضها البعض. توضح هذه الصور أنه يمكن التعرف على وميض فائق أكسيد الميتوكوندريا المفرد المصحوب بإزالة الاستقطاب الغشائي في صور المسح الضوئي ثنائية الأبعاد التسلسلية ، والتي أظهرت زيادة مضان عابر على إشارات الخلفية في كل من أنسجة العضلات الهيكلية وعضلة القلب. إلى جانب الدقة العالية ، يلزم أيضا كثافة مضان كافية.

يمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل شدة الليزر والكسب في قنوات التجميع. بشكل عام ، يتم ضبط إشارة التألق القاعدية من الخلية على ثلث إلى ربع الكثافة القصوى للقناة. نظرا لأن مستوى التعبير عن M-T-C-P-Y-F-P وتحميل TMRM يمكن أن يختلف بين ، يجب إجراء ضبط دقيق لظروف التصوير لكل تجربة ، سواء الاضطرابات الفسيولوجية والمرضية ، مثل ركائز التمثيل الغذائي.

استخدام التحفيز الكهربائي كما هو موضح هنا ، وإعادة التروية الإقفارية لإظهار أن نشاط وميض الأكسيد الفائق يستجيب للتغيرات في حالة التمثيل الغذائي الخلوي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على التخدير المناسب للفم والحالة الصحيحة للقلب المنفخ. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل نقص التروية والاندماج من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا أثناء ابيضاض الدم في عضلة القلب وإصابة إعادة التروية.