طريقة إعداد الشرائح للحفاظ على هندسة الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية

تحافظ طريقة تحضير الشرائح ثلاثية الأبعاد هذه على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا كما هو موضح في الخلايا الجرثومية الخصية للفئران. أولا ، قم بحفر الأنابيب الحديدية لإزالة المواد السيتوبلازمية وتحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف الملطخة مثل الأجسام المضادة ومجسات الأسماك. بعد تثبيت المواد النووية ، قم بفصل الخلايا الجرثومية ميكانيكيا بالملقط والسيتوزين العينات على الشرائح.

بعد ذلك ، احصل على بيانات بأقسام Z متعددة لتغطية نواة ثلاثية الأبعاد عند تطبيقها بشكل استراتيجي من استعدادات الشرائح ثلاثية الأبعاد. باستخدام COT ، يمكن لأسماك الحمض النووي الريبي أن تظهر الحمض النووي الريبي النووي الناشئ للكشف عن المناطق النشطة النسخ في النواة. لقد طورت هذه الطريقة عندما كنت في مختبر الجينات في مستشفى ماساتشوستس العام.

في ذلك الوقت ، قمت بتحسين طريقة تحضير الشرائح لرؤية فلورسنت الحمض النووي الريبي القطني للتهجين ، والتي تسمى أيضا الأسماك للكشف عن الأنفاس. حمض الريبونوكلييك (RNA). يمكن لمجسات القطن تهجين التسلسلات المتكررة في الإنترونات و tls وتصور موقع النسخ النشط. تتطلب أسماك RA القطنية الحفاظ على توزيع الحمض النووي الريبي النووي.

النقطة الأساسية لطريقة التحضير الصحيحة هذه هي أن خطوات التثبيت تحتاج إلى المضي قدما في خطوة التثبيت. لإزالة الخلفية البلازمية Cy ، اكشف عن أنابيب OUS من الخصية الممزقة في PBS على الجليد ، ونقل عدة قطع من الأنابيب من خمسة إلى 10 ملليمترات في الطول إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت CSK مع 0.5٪ tritton X 100 ، واحتضانها لمدة ست دقائق على الجليد. الآن انقل جميع الأنابيب إلى محلول 4٪ P-F-A-P-B-S في بئر واحد من أربعة أطباق احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، احتضان جميع الأنابيب في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد غرف cyto spin و cyto spin خلال فترات الحضانة على الجانب الخلفي من شريحة زجاجية ، وانقل جميع الأنابيب إلى 30 ميكرولتر من PBS. ثم استخدم أطراف ملقطين لتمزيق الأنابيب إلى أشلاء.

اقطع الأنابيب في اتجاه أفقي عن طريق قص الأنابيب بين أطراف ملقطين وسحب الملقط أفقيا. بعد إضافة 30 ميكرولتر من PBS ، قم بخلط التعليق عن طريق سحب العينات ، ثم نقله إلى أنبوب طرد مركزي صغير وأضف PBS إلى الحجم الإجمالي البالغ 1.3 ملليلتر. الآن قم بتطبيق 100 ميكرولتر من التعليق على كل غرفة من غرف دوران cyto. خلوية.

قم بتدوير العينات بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جفف الشرائح على مقعد المختبر لبضع دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام برطمان مشترك يحتوي على PBS. اغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل الشرائح إلى 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين على الأقل. في تفاعل 20 ميكرولتر ، أضف 100 نانوجرام تم صيده ، ومسبار NA 1D ، ومركب فاناديل ريبونوكليوتيد 20 مللي مولار ومخزن مؤقت للتهجين. باستخدام جهاز PCR ، احتضن لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية ، متبوعا ب prea.

خطوة الركوع عند 42 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. الآن قم بتجفيف الشرائح على التوالي في 80٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين ، متبوعا بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين. ينزلق التجفيف تماما على مقعد المختبر في درجة حرارة الغرفة.

الآن ضع الشريحة على حجرة صندوق الأطراف عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة للمجسات التي تحتاج إليها وماصتها مباشرة على الشرائح المجففة. ضع غطاء برفق فوق الشريحة لخطوة التهجين لمدة ست ساعات على الأقل عند 42 درجة مئوية.

قم بتسخين محاليل الغسيل في برطمانات coplan على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي باستخدام شفرة حلاقة ، وقم بإزالة زلة الغطاء من حافة الشريحة دون خدش العينات ، واغمر الشرائح تدريجيا في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق لكل منها. بدءا من جرة الكوبلان الأولى التي تحتوي على اثنين من XSSC و 50٪ من النموذج amid ، متبوعا بجرة الكوبلان الثانية التي تحتوي على اثنين من XSSC و 50٪ من النموذج amid. ثم آخر جرار يحتوي على اثنين من XSSC.

ثم أضف 20 ميكرولترا من وسائط التثبيت DPI إلى العينات وضع زلة غطاء. اضغط برفق على زجاج الغطاء وامسح وسائط التثبيت الإضافية بمنديل تنظيف. في هذه التجربة ، تم إجراء سمكة RNA واحدة للكشف في وقت واحد عن النسخ الناشئ والتلوين المناعي للبروتينات التي تتمركز في الكيمياء المناعية لجسم XY.

في وحدة العناية المركزة هذه ، اكتشفت الخلايا المنوية بروتين الكروماتين غير المتجانس CCB X واحد وأيضا شكل فسفرة من متغير هيستون H two A X على جسم XY. يمسك ال ينتج سمكة واحدة إشارات يتراكم على ال [إ] مناطق لونية في [سبريدس] سطحية يعالج مع محلول [هيبوتونيك]. تتعطل بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد ويمكن التقاط جميع محاور الكروموسوم العضلي داخل مستوى Z واحد.

ذلك ، فإن إعداد الشريحة ثلاثية الأبعاد يحافظ على بنية الكروماتين السليمة باتباع هذا الإجراء. طريقة التحضير الصحيحة هذه قابلة للتطبيق على أسماك الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي المناعي ، والجمع بين طرق الكشف هذه.