أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

الهدف العام من التجربة التالية هو متابعة نمو الأسنان على مدار عدة أيام. في ثقافة التخطيط, يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الفك السفلي النامية لفئران الجنين إلى شرائح حية لكشف جراثيم الأسنان النامية كخطوة ثانية. يتم اختيار الشرائح ووضعها على مرشحات فوق وسط استزراع وتحضينها للسماح بالتطوير.

يتم تمييز الشرائح التالية بتتبع النسب من أجل تتبع الحركة الخلوية خلال فترة الثقافة ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر الطبيعة الديناميكية لأنسجة الأسنان أثناء تطورها أثناء زراعة التخطيط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على ثقافة الزرع التقليدية هي أنه يمكن ملاحظة الأعضاء النامية داخليا مثل أحجار الأسنان الكريمة طوال تطورها في سياق الأنسجة المحيطة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد تكون خطوات التقطيع والاختيار صعبة إذا كان إعداد الماكينة أو اتجاه الأنسجة غير دقيق.

أولا ، قم بإعداد وسط التشريح والثقافة للأعضاء الجنينية عن طريق إضافة 1٪ غلوتامات و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى 500 مل من وسط النسر المعدل المتقدم ECCOs F 12. ثم ، كما هو موضح في مقال الفيديو الذي كتبه تاكاهاشي ، يقوم سومي بتشريح أجنة الفئران بين المرحلتين E 11.5 و E 15.5 من التطور ووضعها في طبق بتري يحتوي على وسط طازج. بعد ذلك ، قم بقطع رأس الأجنة باستخدام إبرة تنجستن معقمة حادة حديثا وانقل الرؤوس إلى طبق طازج من وسط مبرد مسبقا على الجليد.

ثم عزل الفك السفلي عن الرؤوس عن طريق وضع إبرة في تجويف الفم وقطع الجزء الخلفي من الرأس مؤقتا. قم بتخزين الفك السفلي المعزول في وسط مبرد مسبقا على الثلج قبل تقطيعه. قبل تقطيع الأنسجة الصالحة للفك السفلي ، قم بتنظيف قرص التثبيت وشفرة مفرمة الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وتأكد من أن الشفرة متدفقة مع قرص التثبيت.

عندما تسقط ، ستحتاج الشفرة إلى الاستبدال بعد تقطيع ما يقرب من 200 فك سفلي ، وضبط مسافة القطع على ما بين 200 و 400 ميكرومتر وفقا لعمر العينة ، واعتمادا على ما إذا كانت جرثومة الأسنان بأكملها مطلوبة لجنين E 14.5 حيث يلزم عزل جرثومة الأسنان ، يتم استخدام مسافة قطع تبلغ 250 ميكرومتر. بعد ذلك ، انقل الفك السفلي إلى قرص التثبيت البلاستيكي وقم بترتيبه بحيث يكون اللسان النامي في اتجاه عرضي أمامي. عند تشريح الأضراس لعزل القواطع ، خذ شرائح سهمية من خلال الفك السفلي.

بمجرد توجيهه بشكل صحيح ، قم بإزالة الوسط الزائد من حول الأنسجة. باستخدام ورق الترشيح ، سيؤدي ذلك إلى دفع الفك السفلي قليلا لتثبيته في مكانه على قرص التثبيت. مباشرة بعد التجفيف بورق الترشيح ، ضع القرص على طاولة دائرية من الفولاذ المقاوم للصدأ للمروحية.

ثم اضبط قوة الشفرة على الحد الأقصى ، وقم بتشغيل الجهاز واضغط على ابدأ. يجتاز الجدول تلقائيا من اليسار إلى اليمين بينما في نفس الوقت يتم رفع ذراع التقطيع الذي يحمل الشفرة وإسقاطه بسرعة تصل إلى 200 ضربة في الدقيقة. بمجرد تقطيع الأنسجة بالكامل ، قم بإيقاف تشغيل الجهاز.

تأكد من أن ذراع الشفرة في الوضع المرتفع، ثم قم بإزالة القرص. تأكد من عدم وضع أصابعك أسفل ذراع الشفرة أو ترك الجهاز دون رقابة. عند تقطيع المناديل ، خذ قرص التثبيت وأضف على الفور وسيطا إلى الشرائح الموجودة على القرص لمنع التجفيف المفرط.

ثم قم بإخراج الأنسجة الشريحة بعناية من أسفل القرص باستخدام إبرة التنغستن أو ماصة الماصة في طبق بتري صغير متوسط. بعد ذلك ، افصل الشرائح الفردية باستخدام إبرة ثم حدد شرائح الأنسجة التي تحتوي على منطقة الاهتمام تحت مجهر استريو. ضع شرائح مختارة في أطباق ثقافة طازجة ومتوسطة ، وقم بإعداد شبكات معدنية لنظام الاستزراع عن طريق قطع الشرائط ، بقياس أربعة سنتيمترات × 1.5 سم من صفائح من الفولاذ المقاوم للصدأ نسج عادي.

ثم قم بعمل ثقب في المنتصف باستخدام ثقب ثابت قياسي وثني الجوانب بحيث تتناسب الشبكة بشكل مسطح عبر البئر المركزي وتقع بالتوازي مع قاع الطبق. بمجرد تشكيل الشبكات بشكل صحيح ، قم بتعقيمها في الأوتوكلاف قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد أطباق زراعة أعضاء البئر المركزي للثقافة عن طريق إضافة ملليلترين من ماء الأوتوكلاف إلى البئر الخارجي لمنع الجفاف.

ثم ضع شبكة معدنية معقمة عبر منتصف الطبق. قم بقص قطعة من غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت الشفاف بحجم مسام 0.4 ميكرومتر بحيث تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الفتحة الموجودة في الشبكة. ثم ضع الغشاء المقطوع في الطبق بشريحة فك سفلي مختارة إذا كان تتبع النسب مطلوبا.

قم أولا بإعداد إبرة شعرية زجاجية عن طريق سحب الزجاج باستخدام مجتذب إبرة. ثم اكسر طرف الإبرة وضعه لأسفل في محلول صبغة محبة للدهون مثل عين داي أو داي أو ، وارسم بعضا من محلول الصبغة عن طريق العمل الشعري. بعد بضع دقائق ، ضع الإبرة المملوءة في حامل وقم بتوصيلها بشفطة الفم.

ضع طرف الإبرة في وسط المزرعة بحيث تلامس المنطقة المراد تسميتها ، مثل بصيلات الأسنان الموضحة هنا. ثم قم بإزاحة كمية صغيرة من الصبغة على الأنسجة. بعد ذلك ، انقل الشريحة إلى مرحلة المجهر الفلوري وتحقق من تصنيف الشريحة بنجاح.

بمجرد وضع العلامات بنجاح ، ارفع الشريحة بعناية أعلى الغشاء ثم انقل الغشاء خارج الوسط مع تسطيح الشريحة في المنتصف. ثم ضع المرشح فوق الفتحة الدائرية في وسط الشبكة عند ما يقرب من ملليلتر واحد من وسط الثقافة إلى البئر حتى يصبح مستوى الوسط على مستوى الغشاء. في هذه المرحلة ، أضف أي بروتينات أو مثبطات جزيئات صغيرة إلى الوسط.

أيضا ، قم بتصوير الشريحة لتسجيل التشكل في اليوم صفر باستخدام مجهر تشريح للحصول على أفضل تصوير فوتوغرافي ، وعرض الشرائح بمصدر ضوء من الأسفل. حافظ على الأطباق في جو رطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام على فترات منتظمة. استمر في تصوير الثقافات من أجل تتبع التقدم.

تظهر هنا سلسلة من الصور التي توثق تطور أول بصيلات أسنان ضرسية ، والتي تم تصنيفها بصبغة صبغة الفلورسنت في العين. الشريحة عبارة عن شريحة أمامية بسمك 250 ميكرون تم تشريحها من الفك السفلي للفأر عند E 14.5. يبدأ السن المحدد بنقاط سوداء في مرحلة الغطاء في اليوم الصفر.

بحلول اليوم الرابع ، وصلت جرثومة الأسنان إلى مرحلة الجرس وشوهدت خلايا بصيلات الأسنان تنتشر في قوس حول المينا الخارجية النامية. الظهارة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاث ساعات من الجنين إلى الثقافة النهائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تطور الأعضاء في الثقافة بنجاح.