نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج فأر تجريبي يمكن استخدامه للتحقيق في تداعيات العدوى المتزامنة بالسل والملاريا في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق تعريض التجارب لهم. السل الذي يحتوي على قطرات الهباء الجوي المعدية باستخدام نظام التعرض للاستنشاق.

في الخطوة الثانية ، يتم التحقق من امتصاص العدد المطلوب من مرض السل M عن طريق تحليل CFU لأنسجة الرئة. بعد يوم واحد من الإصابة بالهباء الجوي ، بعد 40 يوما ، تتعرض الفئران للبعوض المعدي للانتقال الطبيعي لبوغات المتصورة ، والتي تترسب تحت الجلد بالكامل أثناء وجبة الدم. في الخطوة الأخيرة ، يتم مراقبة تطور طفيلي مرحلة الدم الملاريا من خلال تحليل بقع giemsa ومسحات الدم.

في النهاية ، يمكن تعداد عبء السل الكهرومغناطيسي في الرئة وعدد الطفيليات في دم المصابة لتحديد مسار السل والملاريا على التوالي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السل والعدوى المصاحبة للملاريا ، مثل كيف تؤثر العدوى المتزامنة بطفيلي الملاريا على التسبب في عدوى المتفطرة السلية ومكافحتها؟ تم تطوير هذا البروتوكول للتحقيق في كيفية تأثير العدوى المصاحبة ببوري الصوديوم على المرحلة المزمنة من السل الميكروبي ، وهو ستة فئران ذات كفاءة مناعية C 57 PL.

يمكن أيضا تطبيقه على سلالات الفئران الأخرى ، بما في ذلك الفئران بالضربة القاضية ، أو استخدامه مع أنواع الفطريات أو أنواع الصوديوم الأخرى. ابدأ بتسخين المتفطرة السلية. مخزون عيار CFU معروف.

عندما تذوب الخلايا ، استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 27 لخلط التعليق بعناية خمس مرات لتفريق الكتل البكتيرية ، وتجنب إنتاج الهباء الجوي ، اعتمادا على جرعة العدوى المطلوبة ، انقل الحجم المطلوب من مخزون البكتيريا الفطرية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على PBS معقم إلى حجم نهائي قدره ستة ملليلتر. بعد ذلك ، ضع التجارب بشكل فردي في سلال شبكية مجزأة. ضع السلال في غرفة الهباء الجوي الدائرية وأغلق غطاء الغرفة.

قم بتوصيل وحدة البخاخات Venturi بوصلات المقبس الثلاثة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بشفط معلق البكتيريا الفطرية في حقنة سعة 10 ملليلتر, مزودة بإبرة حادة قياس 18 واحمل المحقنة إلى غرفة الهباء الجوي في صندوق نقل مغلق. الآن قم بإزالة غطاء برغي البخاخات وحقن تعليق البكتيريا الفطرية بعناية في الوحدة.

الحرص على تجنب توليد الهباء الجوي. تخلص من المحقنة في حاوية أدوات حادة تحتوي على 2٪ بيرتون ، ثم أغلق البخاخات. قم بتشغيل جهاز الاستنشاق عند اكتمال الدورة.

تأكد من أن تعليق البكتيريا الفطرية قد تم رذاذه بالكامل قبل فتح حجرة الهباء الجوي. ارتد خوذات تنقية الهواء التي تعمل بالطاقة ، ثم أعد إلى أقفاصها ، وقم بتعقيم سلال البخاخات وداخل غرفة الهباء الجوي بعد يوم واحد من الإصابة بالبخاخ ، ووضع التحكم الرحيم المعينة على ورق ماص على لوح تشريح في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية ، وتطهير الفئران بنسبة 70٪ من الإيثانول لكل فأر. أولا ، قم بعمل شق صغير في منتصف البطن ثم اسحب الجلد فوق رأس.

بعد ذلك ، استخدم المقص الجراحي لفتح البطن والقفص الصدري. قم بإزالة جدار الصدر بحيث يمكن الوصول إلى الرئتين ، ثم قم بإزالتها. انقل الرئتين إلى أنبوب سعة 15 مليلتر مع ملليلترين من المخزن المؤقت للتجانس ، ثم استخدم المكبس من حقنة سعة خمسة ملليلتر لتصفية الأنسجة من خلال مناخل 100 ميكرومتر في طبق بتري صغير.

باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد مزودة بطرف حاجز ، اغسل المنخل عدة مرات ثم وزع حوالي 250 ميكرولتر من تجانس الرئة على ثماني ألواح أجار. استخدم موزعات يمكن التخلص منها لطلاء العينات بعناية عندما تجف الألواح. ختم كل لوحة مع perfil.

لفها بورق الألمنيوم واحتضانها في وضع مستقيم عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أسابيع على الأقل. لإصابة الفئران الساذجة أو المتفطرة المصابة بالملاريا عن طريق لدغات البعوض ، ضع المخدرة على شباك أقفاص البعوض ، مما يسمح للبعوض المعدي بالتغذي من خلال الغشاء لضمان انتقال البوغات بنجاح. اترك الفئران على الأقفاص لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

انقل الفئران مرة أخرى إلى أقفاصها على منشفة ورقية وقم بتغطيتها بمنشفة ورقية لإبقائها دافئة حتى تستيقظ من التخدير. اقتل البعوض عن طريق رشه بنسبة 70٪ من الإيثانول أو المطهرات الأخرى من خلال شبكة القفص وتعقيم الأقفاص عن طريق تعقيمها. لمراقبة الفقرة ، استخدم إبرة لثقب نهاية الوريد لكل مصاب وجمع قطرة دم واحدة.

في كل طرف من طرفي الشريحة الزجاجية ، استخدم شريحة أخرى لسحب قطرة دم واحدة على نصف طول الشريحة السفلية. ثم اقلب شريحة الانتشار واستخدم الحافة الأخرى للمسحة الثانية. ضع الشرائح في رف تلطيخ.

قم بإصلاح مسحات الدم لفترة وجيزة في الميثانول المطلق ثم جفف في الهواء. الشرائح التالية ، اغمر اللطخات في الجيزة. بعد 10 دقائق ، اغمس الشرائح داخل وخارج شقيق التلوين المملوءة بالماء منزوع الأيونات عدة مرات لشطف البقعة الزائدة.

أخيرا ، قم بتجفيف الشرائح بالهواء في وضع رأسي. تؤدي العدوى الناجمة عن Sporozoite لحيوانات التجربة عن طريق لدغات البعوض إلى معدل إصابة بنسبة 100٪ كما أكد من خلال وجود طفيليات في مرحلة الدم بعد أربعة إلى خمسة أيام. كما هو موضح في الجدول ، فإن إصابة كل من الفئران الساذجة والسل المصابة بالبرازموديوم بوري عن طريق لدغات البعوض تؤدي إلى عدوى متسقة وقابلة للتكرار لجميع داخل مجموعة تجريبية.

من خلال مقارنة الفئران المسبقة والساذجة مع تلك المصابة بالمتفطرة السلية ، يمكن ملاحظة أن المباح المسبق يتأخر قليلا. في الفئران التي أصيبت مسبقا بالمتفطرة السلية في الفئران المصابة بالمتفطرة السلية باستخدام نظام التعرض للاستنشاق ، يؤدي إلى ترسب ناجح للبكتيريا في رئتي مع تباين منخفض نسبيا بين الفئران الفردية. تزداد الأحمال الفطرية في رئتي الفئران الستة السوداء C 57 المصابة في وجود p burga.

في المقابل ، فإن الفئران المصابة بالعدوى المشتركة لديها انخفاض في شبه الدم مقارنة بالفئران المفردة المصابة بالمتصورة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل قياس التدفق الخلوي PCR Eliza أو التقنيات النسيجية على الأنسجة أو سوائل الجسم ذات الأهمية لتشريح الاستجابات المناعية المستحثة في وقت واحد ضد الطفيليات السيئة والدرنة الأساسية وتفاعلاتها في المضيف المصاب بالمشترك. لا تنس أن العمل مع بكتيريا السل الدقيقة التي تسبب في الإنسان مسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتخاذ تدابير لتجنب التعرض للهباء الجوي المعدي في جميع الأوقات.

ويجب الاضطلاع بجميع الأعمال التجريبية التي تنطوي على بكتيريا السل الدقيقة في مرافق مناسبة من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية.