تحويل الخميرة والاستنساخ

تعد الخميرة، أو Saccharomyces cerevisiae، كائناً نموذجياً حقيقيا النواة بسيطاً ومنتشراً يُستخدم في دراسة الوراثة وبيولوجيا الخلية، مما يوفر رؤى حول العمليات الخلوية البشرية. يتناول هذا الفيديو عملية التحول - وهي عملية امتصاص الخلية الخميرية للحمض النووي الغريب. سيعرض الفيديو بلازميدات الخميرة، وكيفية تحضير خلايا الخميرة للتحول، وإجراءات التحول خطوة بخطوة، كما سيوفر بعض تطبيقات هذه التقنية الأساسية.

قبل أن نتحدث عن تحويل الخميرة، دعونا نناقش أولاً نوعاً من الحمض النووي DNA المستخدم في عملية التحويل: وهو البلازميد. البلازميد عبارة عن جزيء DNA صغير ودائري ومزدوج السلاسل، يمكنه أن يتجعد بشكل فائق بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام الموجودة في غشاء الخلية.

تحتوي البلازميدات على موقع استنساخ متعدد أو MCS حيث يمكن لإنزيمات القطع الداخلية، المعروفة أيضاً باسم "إنزيمات القطع"، أن تقطع الـ DNA. ومن ثم يمكن ربط قطع الـ DNA المستهدفة التي تم قطعها باستخدام نفس الإنزيمات داخل الـ MCS. كما تحتوي البلازميدات أيضاً على أصل التضاعف أو ORI الذي يعطي إشارة للخلية بمكان بدء عملية التضاعف. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك البلازميدات علامة اختيار، والتي تسمح لخلايا الخميرة التي تحتوي على البلازميد بالنمو في ظل ظروف بيئية محددة. أما الخميرة التي لا تدمج البلازميد بنجاح فلن تنجو في الأوساط التي تحتوي على علامة الاختيار. ويمكن لعلامات الاختيار أن تشفر جينات تمنح مقاومة للأدوية أو جينات تشفر إنزيمات تمكن سلالة الخميرة من تخليق أحماض أمينية لا يمكنها إنتاجها في الحالة العادية.

ناقلات المكوك هي بلازميدات يمكنها التضاعف في أكثر من نوع واحد من المضيفات. على سبيل المثال، يمكن لبلازميد من E. Coli أن ينمو في الخميرة. ويمكن أن تكون بلازميدات الخميرة غير مدمجة أو مدمجة، مما يعني أن البلازميد إما أن يتحد مع الـ DNA الجينومي أو يظل مستقلاً.

هناك خمسة أنواع عامة مختلفة من البلازميدات أو الناقلات المستخدمة في الخميرة. والنوعان الأكثر استخداماً في تحويل الخميرة هما بلازميد الخميرة الإيبيسومي أو YEp وبلازميد الخميرة السنتروميري أو YCp. يحتوي كلا هذين النوعين من الناقلات على تسلسل تضاعف ذاتي أو ARS. ويحتوي الـ ARS على أصل التضاعف ويسمح بالتضاعف خارج الكروموسومات في الخميرة.

توجد عدة إجراءات مختلفة يمكن استخدامها لتحويل الخميرة، بما في ذلك طريقة السفيروبلاست (spheroplast)، والتثقيب الكهربائي (electroporation)، والتحويل بوساطة خلات الليثيوم. وسنركز في هذا الفيديو على إجراء خلات الليثيوم.

في طريقة التحويل هذه، تعمل كاتيونات الليثيوم موجبة الشحنة على تحييد الشحنات الموجودة على الغشاء الخلوي والحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA). ويرتبط الحمض النووي أحادي السلسلة (Single-stranded DNA) - الذي يُضاف إلى خليط التحويل - بجدار خلية الخميرة، مما يترك الحمض النووي البلازميدي متاحاً لامتصاصه من قبل خلايا الخميرة. ويؤدي التعرض لزيادة مفاجئة في درجة الحرارة، أو ما يعرف بالصدمة الحرارية، إلى إحداث فرق في الضغط بين الجزء الداخلي والخارجي للخلية، مما يؤدي إلى تكوين مسام يمكن للحمض النووي البلازميدي المرور من خلالها. وعندما تنخفض درجة الحرارة، يعود جدار خلية الخميرة ليتشكل من جديد وبذلك تكتمل عملية التحويل.

لنبدأ بإجراء خطوة بخطوة حول كيفية تحضير الخميرة للتحول. يجب تحضير خلايا الخميرة أولاً باختيار مستعمرة من طبق آغار وتضخيم هذه المستعمرة في وسط مستخلص الخميرة والببتون والدكستروز، والذي يُختصر بـ YPD - وهو وسط كامل لنمو الخميرة.

بعد اختيار المستعمرة من الطبق ووضعها في وسط YPD، يتم تحضين المزرعة طوال الليل عند 30 °C مع التقليب باستخدام جهاز هزاز أو أسطوانة دوارة، كما ترون هنا. يتم تجميع خلايا الخميرة في شكل كريات عن طريق الطرد المركزي وإزالة السائل الطافي. ثم تُعاد معلقة الخلايا المجمعة في المنظم المطلوب أو الماء المعقم. ستُستخدم خلايا الخميرة المختصة والمحضرة هذه في عملية التحول.

بمجرد تحضير خلايا الخميرة، يمكن إجراء عملية التحول من خلال تحضير خليط التحول أولاً.

يجب أن يتضمن هذا الخليط الكاشف ما يلي: ماء مقطر معقم؛ ومحلول بولي إيثيلين جليكول بنسبة 50% أو PEG، و1M خلات الليثيوم، ومحلول DNA أحادي السلسلة بتركيز 10 mg/ml، وDNA البلازميد، وخلايا الخميرة المختصة. يجب حساب النسب الدقيقة لكل محلول قبل بدء التجربة من خلال مراجعة البروتوكول القياسي لمختبركم الخاص بتحول الخميرة.

ثم يتم تحضين الخليط عند 30 °C لمدة 30 دقيقة مع الرج. يجب خلط المحلول، وليس استخدام جهاز الفورتكس (vortex)، لضمان عدم تكسر خلايا الخميرة.

تتعرض الخلايا لصدمة حرارية عن طريق وضعها في حمام مائي عند 42 °C لمدة 15 دقيقة، يلي ذلك التبريد على الثلج لمدة دقيقتين. ثم يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

تُعاد معلقة الخلايا في ماء مقطر مرتين وتُوضع على أطباق آغار تختار المحولات المطلوبة. ثم يتم تحضين أطباق التحول عند 30 °C لمدة تتراوح من يومين إلى أربعة أيام حتى تتشكل المستعمرات.

يجب أن تتضمن إجراءات التحول دائماً أطباق تحكم إيجابية وسلبية حتى يتم تحسين العملية. يجب أن يكون التحكم الإيجابي عبارة عن معلق خلايا خميرة مع DNA البلازميد على طبق YPD لا يحتوي على أي علامة اختيار. وهذا يوضح أن الخلايا سليمة بعد إجراء عملية التحول. أما طبق التحكم السلبي فيجب أن يكون معلق خلايا خميرة على طبق اختيار مناسب، مثل الطبق الذي يحتوي على مضادات حيوية. يجب ألا يحتوي هذا الطبق على أي مستعمرات، مما يثبت عدم وجود تلوث.

هناك عدد لا يحصى من التطبيقات المختلفة لتحويل الخميرة. أحد تطبيقات الخميرة المحولة هو استخدام نظام الهجين الثنائي للخميرة (yeast-two hybrid system) لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع البروتين المستهدف، أو ما يسمى ببروتين الطعم (bait protein). عندما يتم تحويل بلازميد من مكتبة من الشركاء الرابطين المرشحين، أو بروتينات الفريسة (prey proteins)، ويحدث تفاعل، يتم تحرير عامل نسخ يعمل على تنشيط جين مراسل، مثل Beta-galactosidase. سيقوم الجين المراسل بتحويل المستعمرات التي حدث فيها تفاعل إلى اللون الأزرق عند وضعها على أطباق تحتوي على X-gal — وهي مادة ركيزة لإنزيم beta-galactosidase.

يمكن هندسة عمليات حذف متعددة في الخميرة من خلال تقنية تستخدم الدورة الجنسية. حيث يتم دمج الخلايا أحادية الصيغة الصبغية (Haploid cells) التي تحتوي على مراسل وموقع محذوف في خلية واحدة من خلال التوزيع العشوائي أو إعادة التركيب الميوزي. وتُستخدم علامات اختيار لانتقاء الخميرة التي دمجت عمليات الحذف بنجاح. في هذه الحالة، يُستخدم قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) لاختيار الخلايا التي تعبر عن GFP.

يمكن تحويل الخميرة ببروتينات موسومة فلورياً لمشاهدة تأثير الطفرات على التفاعلات بين البروتينات. استخدم هذا المقال المرئي المجهر الفلوري لدراسة تأثيرات الطفرات المختلفة على التفاعلات بين البروتينات الضرورية لعملية الالتقام الخلوي (endocytosis).

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحويل الخميرة. يجب أن تكون الآن على دراية بالجوانب الأساسية للبلازميد، وكيفية تحضير خلايا الخميرة للتحويل، وكيفية تنفيذ إجراء التحويل. وكما هو الحال دائماً، شكراً للمشاهدة!