إنتاج وتنقية النواقل المشتقة من الفيروس الغدي من النوع 2 من غير التكاثرية

خلال السنوات ال 15 الماضية ، أثبتت النواقل المشتقة من الفيروس الغدي من النوع 2 (CAV2) كفاءتها في نقل الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع للتطعيم والعلاج الجيني. وهنا نصف إجراء لبناء وإنتاج وتنقية نواقل CAV2، مما يؤدي إلى ظهور معلقات فيروسية عالية العيار.

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء وإنتاج وتنقية الفيروس الغدي من النوع الثاني من النواقل المشتقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ الجين محل الاهتمام أولا في بلازميد مكوكي. الخطوة الثانية هي الحصول على بلازميد جيني مؤتلف عن طريق إعادة التركيب المتماثل.

بعد ذلك ، العجل المعيب المؤتلف ، يتم إنتاج فيروسين وتضخيمهما في خط خلوي مكمل عابر. الخطوة الأخيرة هي تنقية وتركيز الفيروس المؤتلف الناتج لتطبيقات متنوعة في الجسم الحي وفي المختبر. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر المناعي لإظهار أمثلة على النقل الفيروسي في دماغ القوارض.

الميزة الرئيسية لهذه التقنيات على الأساليب الحالية مثل النواقل المشتقة من العصاب البشري هي أنه لا توجد مناعة موجودة مسبقا ضد العجل الثاني في البشر. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات التطعيم أو العلاج الجيني ، مثل تقييم دور البروتينات المعبر عنها في مناطق معينة من الدماغ. لذا فإن إظهار هذا الإجراء سيكون KY و Corin Bergeron.

اثنان من باحثي ما بعد الدكتوراه من مختبراتنا استعد لهذا الإجراء قبل يوم واحد من التعدي عن طريق زرع خلية واحدة من DKE على ستة صفيحة بئر تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في DMEM مع نسبة عالية من الجلوكوز الذي يحتوي على 7٪ حرارة ، وعجل جنين معطل ، وصوديوم مصل ، وبيروفات ، وبنسلين ، وستربتومايسين. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الخلايا 70 إلى 80٪ ملتقية لهضم ميكروغرامين من PCAL GOI ، والمؤتلف cav اثنين من البلازميد الجينومي مع ASC واحد لإطلاق التسلسل غير الفيروسي للبلازميد ، تحقق من نمط التقييد الناتج بنسبة 0.8٪ يجب أن ينتج عن هضم الرحلان الكهربائي للهلام الزراعي حوالي 31 كيلو قاعدة تحتوي على الجينوم المؤتلف وجزء زوج كيلوقاعدتين يتوافق مع العمود الفقري للبلازميد. امزج الحمض النووي المهضوم مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الرئيسي النفاث والدوامة لمدة 10 ثوان.

أضف أربعة ميكرولترات من الخام النفاث واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. تدور لفترة وجيزة لإزالة القطرات واحتضانها لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف مزيج التعداء بالتنقيط على خلية DKE واحدة.

رجي الطبق برفق لتوزيع المزيج بالتساوي واحتضانه عند 37 درجة مئوية. بعد أسبوع واحد من التعدي ، اجمع الخلايا ووسط الثقافة في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل. تعطيل الخلايا بثلاث دورات تفكير مجمدة.

قم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1 ، 800 مرة G.اجمع المادة الطافية وخزنها عند سالب 20 لانتشار الفيروس اللاحق لنشر الفيروس تصيب طبقة أحادية متجانسة بنسبة 80 إلى 90٪ من DKE خلية واحدة تزرع في بئر واحد من ستة صفيحة بئر مع 0.5 مل من الفيروس المحتوي على طاف. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تحت تحريض خفيف بعد ساعة واحدة. قم بإزالة اللقاح واستبدله ب 1.5 مل من DMEM الكامل الذي يحتوي على 5٪ FCS المعطل للحرارة يحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.

يجب مراقبة الخلايا يوميا لظهور تأثير اعتلال الخلايا أو CPE. إذا لم يكن CPE واضحا مرئيا. حصاد الخلايا بعد أربعة أيام من الثقافة وكرر التضخيم الفيروسي عندما يؤثر CPE الواضح على غالبية الخلايا.

عادة بعد جولتين إلى أربع جولات تضخيم فيروسي ، اجمع الخلايا ذات وسط المزرعة وتجميد الذوبان ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. تصيب 80 إلى 90٪ ملتقية. تنمو خلايا DKE واحدة في ثلاثة أطباق زراعة أنسجة قطرها 10 سم باستخدام 1.5 مل من الفيروس المحتوي على مادة طافية لكل طبق بعد ثلاثة إلى أربعة أيام عند اكتمال CPE.

خلايا الحصاد من هذه الأطباق التي يبلغ قطرها 10 سم تعطلها بثلاث دورات حرة ومسح المحللة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 1 ، 800 مرة. يجمع G المادة الطافية ويخزن عند سالب 20 لتضخيم Cav الثاني على نطاق واسع لبدء إجراء التوسع يصيب 80 إلى 90٪ من الطبقات الأحادية المتجمعة من DKE خلية واحدة تنمو في 40 أطباق زراعة الأنسجة بقطر 10 سم لكل طبق استخدم 0.1 مل من الفيروس المحتوي على مادة طافية مخففة في مليلتر واحد من DMEM الكامل بدون FCS تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات تحت التحريض الخفيف. بعد ثلاث إلى أربع ساعات ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM الكامل المكمل بنسبة 5٪ FCS واحتضنه لمدة ثلاثة أيام.

بعد ثلاثة أيام ، حصاد الخلايا المصابة من 40 10 أطباق سنتيمترات في 50 مليلتر من أنابيب البولي بروبيلين ، وخلايا الحبيبات عند 1 ، 200 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. يعلقها Resus في 15 مل من DMEM المتوسط يعطل الخلايا بثلاث دورات تجميد وذوبان. قم بإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 800 مرة G لمدة 10 دقائق.

قم بتخزين المادة الطافية عند سالب 20 قبل تنقية الجسيمات الفيروسية لتنقية الجسيمات الفيروسية. قم بإعداد تدرج كلوريد السيزيوم المتقطع في أنبوب UltraClear سعة 14 مل. أولا ، صب ملليلترين من محلول كلوريد السيزيوم عالي الكثافة في قاع الأنبوب.

ثم أضف ببطء ملليلترين من محلول كلوريد السيزيوم منخفض الكثافة فوق المحلول الأول. قم بتحميل المادة الطافية الفيروسية بعناية فوق تدرج كلوريد السيزيوم. املأ الأنبوب بالزيت المعدني حتى ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من جهاز الطرد المركزي العلوي في دوار SW 40 متأرجح لمدة ساعة و 30 دقيقة عند 130،000 مرة جم و 18 درجة مئوية بعد الطرد المركزي.

يظهر شريطان أبيضان بوضوح عند الواجهة بين طبقتي محلول كلوريد السيزيوم. باستخدام إبرة قياس 21 وحقنة ، اجمع الشريط السفلي الذي يحتوي على جزيئين ناضجين من التكافؤ الجانبي. حاول قدر الإمكان تجنب جمع النطاق العلوي الذي يتوافق مع الجسيمات الفيروسية الفارغة.

قم بإعداد تدرج مستمر لكلوريد السيزيوم في أنبوب شفاف سعة 14 مليلتر عن طريق خلط الجسيمات الفيروسية الجماعية بمحلول كلوريد السيزيوم. املأ الأنبوب بالزيت المعدني حتى ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من جهاز الطرد المركزي العلوي في دوار SW 40 متأرجح لمدة 18 ساعة عند 130،000 مرة جم و 18 درجة. بعد الطرد المركزي ، اجمع العجل الأبيض الذي يحتوي على ثقب بشريط بجانب باستخدام حقنة كما هو موضح سابقا.

مرة أخرى ، حاول تجنب جمع النطاق العلوي المتبقي. يجب أن يكون هذا أسهل في هذا التدرج المستمر الذي يفصل بين النطاقين بشكل أفضل. يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للتعليق الذي تم جمعه ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بموازنة عمود cidex G 25 PD 10 مع 30 مل من PBS. قم بتحميل التعليق الفيروسي على العمود وتخلص من التدفق من خلال السطح مع 500 ميكرولتر من كسور PBS تجمع الكسور من خمسة إلى سبعة ، والتي تحتوي عادة على جزيئين من Cav المحلا. يمكن التعرف بسهولة على الفيروس الذي يحتوي على كسور لأن هناك رائحة مباركة.

أخيرا ، أضف 150 ميكرولترا من الجلسرين إلى 1.5 مل من CAV المعلق الثاني وقم بتخزينه في Eloqua عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمعايرة Cav اثنين عن طريق تخفيف نقطة النهاية لإذابة كمية من الفيروس المنقى على الجليد وإجراء تخفيف تسلسلي بعشرة أضعاف يتراوح من 10 إلى سالب اثنين إلى 10 إلى ناقص 12 في DMEM الخالي من المصل. أضف 50 ميكرولترا من كل تخفيف فيروسي في خمسة آبار من صفيحة 96 بئر ، وأضف 1.5 مرة 10 إلى DKE الرابعة خلية واحدة لكل بئر تحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة خمسة أيام في اليوم الخامس. مراقبة ما بعد العدوى ظهور CPE عن طريق الملاحظة المجهرية.

يتم تحديد العيارات المعدية على أنها جرعات متوسطة معدية لزراعة الأنسجة باستخدام الطريقة الإحصائية للقراءة والرجال قبل إنتاج النواقل الفيروسية. يتم إنشاء جينوم CAV المؤتلف الذي يحمل كاسيت تعبير للجين المعدل باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية. أولا ، يتم استنساخ الجين محل الاهتمام في بلازميد مكوكي ككاسيت تعبير مع محفز مبكر للفيروس المضخم للخلايا وإشارة متعددة الأدينيل محاطة بتسلسلين جينيين مشتقين من CAV يمثلان التسلسلات المستهدفة لإعادة التركيب في المنبع والمصب.

في الخطوة الثانية ، يتم إدخال كاسيت التعبير من البلازميد المكوكي إلى جينوم CAV الثاني عن طريق إعادة التركيب المتماثل. سيؤدي إدخال كاسيت تعبير الحكومة العراقية إلى حذف EA وجزء من جين E one B في الجينوم المؤتلف. بمجرد الحصول على البلازميد الجيني المؤتلف ، يتم إنتاج الجسيمات الفيروسية باستخدام CAV اثنين E واحد مكمل DKE خلية واحدة.

يمكن بسهولة تصور تأثير الاعتلال الخلوي الواضح بسبب الكمية الكبيرة من الجسيمات الفيروسية المنتجة في الخلايا المصابة عن طريق الفحص المجهري الساطع أو عن طريق التعبير الجينات المعدلة وراثيا. هذا المثال هو ل GFP يعبر عن CAV اثنين من المتجهين. بعد عدة جولات تضخيم فيروسية باستخدام خلايا DKE واحدة جديدة ، يتم تنقية الجسيمات الفيروسية عن طريق الطرد المركزي الفائق على تدرجات كلوريد السيزيوم.

تظهر الجزيئات الفيروسية المركزة على شكل شريطين لامعين داخل تدرج السيزيوم. يتوافق الشريط السفلي مع التكافؤ المؤتلف الناضج الثاني الذي يجب جمعه. بينما يحتوي الشريط العلوي على جزيئات فارغة غير معدية يجب تجنبها.

يمكن استخدام ناقل العجل المؤتلف الناتج لنقل جميع أنواع الخلايا تقريبا في مجموعة متنوعة من الأنواع ، إما في المختبر أو في الجسم الحي. يظهر هنا أحد الأمثلة على التطبيق الذي تم فيه حقن GFP الذي يعبر عن CAV two بواسطة تاكسي ستيريو في مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفأر. نظرا لأن هذا البروتوكول ينتج عال عيار ومخزون فيروسي نقي نقي ، فإن حقن أقل من ميكرولتر واحد من GFP المخفف PBS الذي يعبر عن ناقل CAV اثنين في التلفيف المسنن أو DG يؤدي إلى 40 إلى 50٪ من التنبيغ العصبي.

علاوة على ذلك ، نظرا لقدرة C two على النقل إلى الوراء في محاور عصبية حقن ميكرولتر من PBS المخفف GFP الذي يعبر عن ناقل CAV اثنين في المخطط يتيح نقل ما يقرب من 80٪ من الخلايا العصبية nigro stri AAL في الغواصات ، nigra pars compacta بعد تطوراتها. تمهد هذه التقنيات الطريق للباحثين في المجالات أو علم اللقاحات أو علوم الأعصاب لاستكشاف مستضدات جديدة ووظيفة الجينات في الدماغ في العديد من النماذج الحيوانية المتنوعة. لذلك لا تنس أن العمل مع ناقلين مشتقين من CAF يمكن أن يكون خطيرا للغاية وحذرا ، مثل تدابير الاحتواء المناسبة ومعالجة النفايات ، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية والعمل في أغطية التدفق الصفحي في BSL ، يجب دائما أخذ مختبرين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.