FtsZ البلمرة فحوصات: بروتوكولات بسيطة واعتبارات

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الظروف المناسبة لدراسة FTSZ والبلمرة والنشاط باستخدام فحوصات ومعدات بسيطة. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء فحوصات ترسيب البوليمر FDSC في ظل ظروف مختلفة لإيجاد الظروف المناسبة التي يتم فيها بلمرة FDSZ. كخطوة ثانية ، نقوم بإجراء فحوصات تشتت الضوء لدراسة بلمرة FDSZ في الوقت الفعلي.

بعد ذلك ، نقوم بإجراء فحوصات التحلل المائي GTP لتحديد نشاط البلمرة المرتبطة g gtpa ل FT SC. تم الحصول على النتائج التي توضح الظروف الأنسب لدراسة FTSC لمصدر بكتيري معين بناء على الترسيب وتشتت الضوء والتحلل المائي GTP. من السهل تنفيذ التقنية الموضحة هنا في أي مختبر وستوفر فكرة سريعة عن قدرات البلمرة لوحدة FT a z محددة. نجد أن اختيار المخزن المؤقت الصحيح مهم بشكل خاص عند العمل مع FTAZ في وجود بروتينات أخرى توضح أن هذه التقنية ستكون زحف EVA ، طالب دراسات عليا من مختبري.

للبدء ، أضف خمسة ميكرولترات من 100 مللي مولر كلوريد المغنيسيوم ، و 12 ميكرومولار من البروتينات البكتيرية ، FDSC و / أو SEP F في أحد مخازن البلمرة المختارة التي تحتوي على قيم وتركيبات مختلفة من الأس الهيدروجيني كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حاضنة بوظيفة اهتزاز واحتضان العينات لمدة دقيقتين عند 30 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة. بمجرد خلط الأنابيب جيدا ، ابدأ البلمرة بإضافة ميكرولتر واحد من خليط GTP أو الناتج المحلي الإجمالي من محلول مخزون 100 ملليمولار بحيث يكون التركيز النهائي ملليمول.

ثم ضع العينات مرة أخرى في حاضنة الاهتزاز لمدة 20 دقيقة إضافية. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة عند 20،000 دورة في الدقيقة باستخدام دوار TLA 55 أو ما يعادله 24،600 Gs إذا كنت تستخدم شيئا آخر. بمجرد انتهاء جهاز الطرد المركزي ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب نظيفة واحتفظ بالكريات لوقت لاحق.

خذ 20 ميكرولترا من المواد الطافية المنقولة واخلطها في أنبوب منفصل مع 20 ميكرولترا من عينة عازلة مركزة مرتين. قم بتأمين الأغطية واغلي العينات لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من عينة مركزة مرتين إلى كل جزء من الحبيبات تم وضعه جانبا مسبقا البوليمرات عن طريق غلي العينات لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية.

بمجرد انتهاء العينات من الغليان ، أضف 50 ميكرولترا إضافيا من الماء منزوع المعادن إلى الأنابيب التي تحتوي على الكريات. بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من كل من المواد الطافية والكريات من كل عينة جنبا إلى جنب على هلام صفحة SDS بنسبة 10٪ وقم بتشغيل الجل عند 150 فولت. بمجرد اكتمال الجل ، قم بإزالة الجل ولطخه باللون الأزرق اللامع Kumasi G two 50.

ثم قم بتصوير الجل وحدد كمية البروتين باستخدام القياس الخلوي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. قم أولا بتشغيل مطياف الفلورسنت واترك المصباح يسخن لعدة دقائق لتجنب التقلبات الحرارية. أيضا ، قم بتشغيل حمام مائي دائري واضبط درجة حرارة الماء على 30 درجة مئوية للحفاظ على غرفة vete عند درجة حرارة ثابتة.

مع ارتفاع درجة حرارة النظام ، حدد معلمات تشغيل مطياف. اضبط الجهد العالي للكاشف على 300 فولت والأطوال الموجية للانبعاث والإثارة على 350 نانومتر بعرض شق يبلغ أربعة نانومتر. ثم قم ببرمجة بروتوكول الحصول على البيانات عن طريق اختيار عملية استحواذ على أساس الوقت لمدة 3 ، 600 ثانية.

قم بتنظيف فطرة مضان سعة 200 ميكرولتر بطول مسار سنتيمتر واحد بعناية عن طريق زناها في محلول تنظيف في حمام مائي لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإعداد 294 ميكرولترا من المزيج الرئيسي لكل من مخازن البلمرة التسعة الموضحة في بروتوكول النص المصاحب ، كل منها يحتوي على 10 مللي مولار من كلوريد المغنيسيوم ، و 12 ميكرومولار FDSE كتركيزات نهائية محسوبة ل 300 ميكرولتر. ثم دوامة لفترة وجيزة ، تنقل المخاليط 196 ميكرولترا من مخزن البلمرة الأول إلى الطبيب البيطري.

ضعه في مقياس الطيف واحتضانه لمدة دقيقتين لرفع درجة حرارة العينة إلى 30 درجة مئوية. بعد دقيقتين ، ابدأ الحصول على البيانات وانتظر لمدة 90 ثانية للتحقق من استقرار الإشارة. ثم أضف أربعة ميكرولترات من 100 مللي مولار GTP أو الناتج المحلي الإجمالي.

امزج العينة واستمر في الحصول على البيانات لمدة ساعة كاملة. كرر هذه الخطوات لكل مخزن مؤقت مدرج. تحضير 1.5 مل من اثنين من مللي مولار GTP في مخزن مؤقت للبلمرة المختار.

قم أيضا بإعداد تخفيف معياري للفوسفات في نطاق صفر إلى 40 ميكرومولار في نفس المخزن المؤقت. بعد ذلك ، قم بإعداد كاشف العمل الأخضر الملكيت كما هو موضح في مجموعة المقايسات الحيوية. ثم قم بتكوين أربعة خلطات رئيسية بحجم إجمالي لكل منها 360 ميكرولتر ، مزيج رئيسي يحتوي أحدهما على FDSZ مشتق من B subtilis ومزيج رئيسي يحتوي على FDSE مشتق من e coli.

يتم استخدام الخلطات الرئيسية الثالثة والرابعة كعناصر تحكم وتحتوي على EDTA بدلا من كلوريد المغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بتعبئة 20 ميكرولتر من الخلطات الرئيسية ومعايير الفوسفات. في صفيحة البئر A-Q-P-C-R 96 بحيث يوجد 16 بئرا لكل مزيج رئيسي ومعايير الفوسفات مرتبة كما هو موضح هنا.

ماصة 180 ميكرولتر من مخزون GTP مللي مولار إلى الممر الأخير من اللوحة. ثم ضع اللوحة في جهاز PCR. قم بتشغيل برنامج بدورة واحدة مضبوطة على 30 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.

في ماصة ثانية 96 بئر ، 20 ميكرولتر من كاشف العمل الأخضر الملكيت في الآبار ، من A إلى H 10. ثم عند 60 ميكرولترا من المخزن المؤقت للبلمرة من التجربة يدعي من A واحد إلى H ثمانية ، بعد ذلك عند 20 ميكرولتر من محلول GTP المليمولي إلى الآبار في كل حارة من اللوحة. واحد على فترات محددة مسبقا كما هو موضح هنا لفحص التفاعل في نقاط زمنية مختلفة.

قم بتوصيل الأنابيب في الخلطات لأعلى ولأسفل لخلطها بعد 30 دقيقة ، بدءا من الممر الأول في اللوحة الأولى ، وانقل 20 ميكرولترا من الممر الأول من اللوحة الأولى إلى الممر الأول من اللوحة الثانية والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. هذه هي نقطة البداية لتطوير اللون الأخضر الملكيت للتفاعل لمدة 30 دقيقة بعد 30 دقيقة ونصف ، قم بنقل 20 ميكرولترا من الممر الثاني من اللوحة الأولى إلى الممر الثاني من اللوحة الثانية واخلطها. هذه هي نقطة البداية لتطوير اللون الأخضر الملكيت لتفاعل 20 دقيقة.

كرر هذه الخطوات مع الممرات المتبقية من ثلاثة إلى سبعة على فترات 32 بعد 33 دقيقة ونصف عند 20 ميكرولترا من GTP إلى الممر الثامن على اللوحة الأولى واخلطها. ثم انقل 20 ميكرولترا إلى الممر الثامن على اللوحة الثانية واخلطه. يمثل هذا تفاعل دقيقة الصفر وهو نقطة البداية لتطوير اللون الأخضر الملكيت.

بعد 34 دقيقة ، أضف 80 ميكرولتر من الممر التاسع من اللوحة الأولى التي تحتوي على معيار الفوسفات إلى الممر التاسع من اللوحة الثانية واخلطها بعد 34 دقيقة ونصف ، انقل 80 ميكرولتر من معيار الفوسفات الثاني في الممر 10 من اللوحة الأولى إلى الممر 10 على اللوحة الثانية واخلطها. ثم قم بإزالة جميع فقاعات الهواء من العينات واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة ونصف أخرى. بعد الحضانة.

ضع اللوحة في قارئ لوحة 96 جيدا بدءا من 60 دقيقة من بداية التجربة. قم بقياس اللوحة عند 630 نانومتر كل 30 ثانية لمدة خمس دقائق بحيث يتم أخذ 10 نقاط زمنية. سيتوافق قياس اللوحة الأول مع الممر الأول ، والثاني مع الممر الثاني ، وبحيث يكون لكل حارة نفس الوقت تماما لتطور اللون الأخضر الملكيت.

بعد ذلك ، احسب الفوسفات الحر في كل عينة باستخدام منحنى المعايرة القياسي للفوسفات وارسم البيانات على أنها إطلاق الفوسفات بمرور الوقت. ثم احسب نشاط التحلل المائي F-D-S-Z-G-T-P من النطاق الخطي للمنحنى. تظهر هنا النسبة المئوية ل SEP F و FDSZ في كريات العينات.

تم استرداد FDSZ في الحبيبات فوق مستويات الخلفية فقط عندما كان كل من SEP F و GTP موجودين أيضا في العينة. القياس المتكافئ الدقيق ل SEPPE و FDSZ في هذه الأنابيب غير معروف ، لكن هذه النتائج تشير إلى وجود seppe أكثر من FDSZ. يظهر هنا التشتت الخفيف ل FDSZ من B subtilis و e coli ، يتم تجميعها في وجود اثنين من المليمولار GTP في المخزن المؤقت لكلوريد البوتاسيوم 50 ملليمول.

يعطي F-D-S-E-B-S إشارة تشتت ضوئية أعلى من 20 إلى 40 ضعفا من FDSC EC اعتمادا على درجة الحموضة العازلة. ومن المثير للاهتمام أن زيادة تركيز كلوريد البوتاسيوم في المخزن المؤقت لم تؤثر بشكل كبير على إشارة تشتت الضوء ل F-D-S-Z-E-C ، لكن إشارة F-T-S-Z-B-S انخفضت بحوالي 80 ضعفا عند الرقم الهيدروجيني 7.5 30 ضعفا عند الرقم الهيدروجيني 6.8 و 45 ضعفا عند الرقم الهيدروجيني 6.5 في 300 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم مقارنة بالمخازن المؤقتة التي تحتوي على 50 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم. تم قياس نشاط التحلل المائي GTP ل FDSZ في ظل ظروف عازلة مختلفة باستخدام مقايسة لونية للفوسفات الحر.

تم العثور على زيادة نشاط GTPS ل FT SZ مع زيادة تركيز كلوريد البوتاسيوم في كل حالة من ظروف الأس الهيدروجيني المختلفة. عند 50 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم ، انخفض نشاط gtpa بسبب تجميع خيوط F-D-S-Z-B-S عند 50 ملليمولار. كان لدى كلوريد البوتاسيوم FDSZ EEC نشاط GTPS أعلى بثلاثة إلى ستة أضعاف من F-D-S-Z-B-S بسبب التفكيك الأسرع لبوليمرات FDSC EEC.

أخيرا ، تم تقليل الفرق في نشاط التحلل المائي GTP بين F-D-S-Z-B-S و F-D-S-Z-E-C عند 300 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم ، ربما بسبب انخفاض تجميع خيوط F-D-S-Z-B-S. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء معادن أخرى مثل الفحص المجهري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق ببنية بوليمرات FTS في العينة.