تصور التدفق السيتوبلازمي أثناء التئام الجروح أحادية الخلية في Stentor coeruleus

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تدفق السيتوبلازم أثناء التئام الجروح في خلية واحدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الخلايا الدعامة الحية أو خلايا SEIUs أولا لاستخدامها كنظام نموذجي للجرح الخلوي. الخطوة الثانية هي تحضير الأدوات الزجاجية لقطع الخلايا.

بعد ذلك ، يتم قطع خلايا ساريوس الدعامة على إعداد مجهر مخصص يسمح بجراحة التكبير المنخفض المتزامنة والتصوير عالي الدقة. الخطوة الأخيرة هي إجراء تحليل حسابي للتدفق السيتوبلازمي باستخدام برنامج قياس تناظر صورة الجسيمات. في النهاية ، يتم استخدام التصوير عالي الدقة للسيتوبلازم لإظهار الاستجابة النشطة للخلايا أثناء التئام الجروح.

يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة الأسئلة الرئيسية حول التئام الجروح الخلوية ، مثل ما إذا كان السيتوبلازم يصبح شبيها بالهلام حول منطقة الجرح من أجل منع التسرب إلى الوسط المحيط. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير أداة معالجة الخلايا وقطعها لأنها تتطلب مهارة يدوية. للبدء في الحصول على دعامة أو خلايا سيريوس من الجسر الطبيعي كما هو موضح بالجير أو من مورد تجاري ، أضف 300 مل من الدعامة المعدلة أو الوسيط المقتبس من الوصفات بواسطة الجير والردع كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

حافظ على الثقافات عن طريق زراعتها في الظلام عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، تنمو ثقافات طحالب الكلاميدوموناس راين هاردي في وسط فوسفات أسيتات ثلاثية. باستخدام طرق الاستزراع القياسية قبل الرضاعة ، اغسل خلايا الكلاميدوموناس عن طريق تدويرها برفق ، وإزالة المادة الطافية وتعليقها في الدعامة أو الوسط المعدل.

قم بتغذية 300 مل من الدعامة أو مزارع الساريوس بحوالي 30 مليون خلية CHM مرتين أو ثلاث مرات في الأسبوع عند الحاجة. اجمع الدعامة أو الخلايا للجراحة. للبدء ، قم بتحريك المزرعة برفق عن طريق فقاعات الهواء من خلال طرف الماصة حتى تبدأ الخلايا في الانفصال والسباحة بحرية.

ثم التقط خلايا السباحة باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد مزودة بطرف تجويف عريض لتجنب قص الخلايا. بمجرد جمعها ، دع الخلايا تستقر. ثم قم بإزالة الماصة ببطء عن الوسائط الموجودة فوقها وأضف دعامة أو وسيطة معدلة جديدة.

قم بإعداد الإبر الزجاجية المستخدمة لقطع خلايا الدعامة عن طريق إمساك قضيبين زجاجيين بالتقليب على وفرة والموقد حتى تبدأ الأطراف في الذوبان. ثم المس طرفي القضيبين معا حتى يندمج الزجاج المصهور. بمجرد أن تندمج ، أخرجها من اللهب واتركها لتبرد لمدة ثانية إلى ثانيتين.

ثم افصلها ببطء لعمل استراحة نظيفة. من الناحية المثالية ، سينتج عن ذلك إبرة يبلغ طولها حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين مع نقطة دقيقة في النهاية. إذا كانت الإبرة الناتجة دون المستوى الأمثل ، فقم بكسر الطرف في الخصر الزجاجي وأعد استخدام القضبان.

بعد ذلك ، استخدم ختما مطاطيا مربعا مطليا بالفازلين لإعداد غرفة مربعة محاطة بالفازلين عن طريق الضغط عليها في زلة غطاء زجاجي. ثم أضف 100 ميكرولتر من الدعامة المعدلة أو الوسط الذي يحتوي على 2٪ ميثيل السليلوز إلى مربع الفازلين. ضع زلة الغطاء المحضرة في محول بلاستيكي ثم أضف خلايا الدعامة المغسولة إلى زلة الغطاء.

أخيرا ، رتب الخلايا في ميثيل السليلوز بحيث تكون متباعدة بشكل متساو ويتم دفعها بالقرب من سطح زلة الغطاء لتكون في بؤرة التركيز أثناء التصوير. للبدء ، ضع الشريحة على مسرح المجهر المقلوب. ثم قم بإزالة جسم المجهر التشريح من حامله وحدد الموضع التقريبي الذي يجب وضعه فيه من أجل تصور الشريحة بتكبير منخفض من الأعلى.

بعد ذلك ، قم ببناء مجهر ذو طابقين عن طريق إضافة صندوق من الورق المقوى مع التباعد المطلوب بين عدسة المجهر المقلوب ونطاق التشريح. قم بلصق الصندوق في مكانه باستخدام شريط المختبر بحيث يمكن إزالته بسهولة عند اكتمال التجربة ، تأكد من أن العينة ستكون في مجال الرؤية وفي بؤرة التركيز دون الحاجة إلى تحريك نطاق التشريح بعد توصيله ، ثم أمسك نطاق التشريح على الصندوق وقم بلصقه على الصندوق باستخدام شريط المختبر. بعد ذلك ، قم بإعداد المجهر المقلوب باستخدام بصريات DIC عن طريق وضع هدف هواء 20 × في مكانه.

أيضا من استخدام مكثف DIC لمسافة العمل الطويلة لتوفير مساحة كافية لإجراء الجراحة المجهرية من الأعلى. ثم اجعل الخلايا في بؤرة التركيز باستخدام المجهر المقلوب مع كل شيء جاهز وفي التركيز من كلا الجانبين. ابدأ في الحصول على صور بمعدل إطارات يبلغ صورتين في الثانية ، باستخدام كاميرا CCD بخمسة 12 × خمسة 12.

ثم قطع الخلية باستخدام الإبرة الزجاجية. التقط نمط التدفق السيتوبلازمي الأولي وراقب جميع مراحل عملية الجرح والتئام الجروح. قم بإنهاء الاستحواذ عندما تستأنف الخلية المظهر الطبيعي أو تبدأ مرة أخرى في الحركة النشطة.

للبدء ، قم بتنزيل مختبر PIV حزمة MATLAB لقياس التدفق السيتوبلازمي باستخدام تناظر فيلوك صورة الجسيمات. بعد ذلك ، قم بتحميل مكدس صور TIFF لكل تسلسل فيديو في برنامج تناظر veloc لصورة الجسيمات داخل دليل MATLAB. قم بإنشاء قناع يدويا لكل مكدس صور لإخفاء مناطق البيانات الأولية خارج نص الدعامة.

ثم قم بتعيين مختبر PIV لاستخدام إعداد تحويل فورييه السريع وحجم سلة 64 × 64 بكسل ، والذي سيضع وحدات البكسل في كل إطار في وحدات بكسل مربعة أكبر. بعد ذلك ، قم بتشغيل مختبر PIV لحساب الارتباطات المتقاطع بين وحدات البكسل في كل إطار مع وحدات البكسل القريبة. في الإطار التالي ، سينتج عن ذلك متجه تدفق يعتمد على الوقت متمركزا في كل بكسل منحني ، والذي له نفس دقة الوقت مثل البيانات الأولية.

ثم احسب المتوسطات الزمنية لمخرجات حقل المتجه الناتج من أجل مقارنة البيانات المأخوذة بالدعامة قبل القطع وأثناء التئام الجروح. أيضا ، احسب الرسوم البيانية لسرعات التدفق لدراسة شدة التدفق وتغير السرعة عند بكسل معين بمرور الوقت من أجل دراسة تقلبات التدفق. عند تصوير التسلسلات مع دعامة أو خلية مشقوقة إلى النصف ، احسب التدفق الكلي للسيتوبلازم مرة أخرى إلى جسم الخلية بشكل صحيح عن طريق ضرب متوسط سرعة التدفق في مساحة المقطع العرضي لقاعدة فقاعة السيتوبلازم خارج الخلية.

يظهر هنا تصوير مباشر لدعامة أو خلية أثناء قطعها وتعطيلها بإبرة زجاجية. بعد القطع ، تم سحب كمية كبيرة من السيتوبلازم من جسم الخلية الرئيسي ، لكنه يتدفق بسرعة مرة أخرى إلى الخلية. بعد هذا الإجراء ، يمكن إضافة مثبطات كيميائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل مكونات الهيكل الخلوي التي قد تساهم في الحركة السيتوبلازمية أثناء الدعامة أو التئام الجروح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أدوات قطع الدعامة لخلايانا وكيفية تصوير التدفق السيتوبلازمي أثناء عملية القطع والتئام الجروح داخل الخلية العملاقة الواحدة.