إنشاء الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم لعامل مضاد للميكروبات للخلايا العوالق (MBC-P) وخلايا بيو فيلم (MBC-B)

يقارن هذا الإجراء بشكل مباشر مقاومة العوالق والأغشية الحيوية لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل غشاء حيوي. أولا ، قم بإنشاء غشاء حيوي ، وتجديد الوسائط وتطبيق التخفيف التسلسلي للعامل المضاد للميكروبات المفضل. ثم اسمح للخلايا بالتعافي في شكل جديد ومتوسط.

الآن فحص لصلاحية الخلايا عن طريق الطلاء على مثقب LB. في النهاية ، يتم استخدام تحديد الحد الأدنى من تركيز مبيد للجراثيم لخلايا العوالق والأغشية الحيوية لإظهار الزيادة في المقاومة الناتجة عن النمو في الأغشية الحيوية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم يلوثون الآبار المجاورة ، أو يفشلون في ترك شوكات الجهاز متعدد المحاور تبرد بدرجة كافية حتى لا تقتل البكتيريا.

المزرعة ، النوع البري والسلالة الطافرة من البكتيريا لمدة 16 ساعة في وسط غني عند 37 درجة مئوية ، تخفف المزارع المشبعة بين عشية وضحاها في وسط جديد مثل M 63 ، متوسط الحد الأدنى ، مكمل بالمغنيسيوم والكبريتات والأرجينين. ثم Eloqua. 100 ميكرولتر لكل بئر.

تخصيص 24 بئرا لكل سلالة ، احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد 10 محاليل مخزون من سلسلة تخفيف المضادات الحيوية لسبعة آبار وتخزينها على الجليد. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة المادة الطافية المستهلكة التي تحتوي على خلايا العوالق.

ثم أضف 90 ميكرولترا من M 63 إلى جميع الآبار وأضف 10 ميكرولترات من محلول مخزون المضادات الحيوية المناسب إلى التحكم في عدم وجود مضادات حيوية. حسنا ، لكل تكرار وسلالة ، أضف 10 ميكرولتر من الماء. احتضن لوحة العيار الصغير لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة المادة الطافية المستهلكة التي تحتوي على خلايا العوالق. أضف 115 ميكرولترا من M 63 إلى جميع الآبار واستمر في زراعة الثقافات لمدة 24 ساعة. عند 37 درجة مئوية.

قم بتسمية لوحة مثقاب واحدة لكل نصف 96. حسنا ، لوحة ميكروتيتر لتعقيم الجهاز متعدد المحاور ، وغمسها في 100٪ من الإيثانول وتمرير الشوكات عبر اللهب المكشوف لموقد بنسن. دع الشوكات تبرد قليلا.

باستخدام أطراف الشوكات. انقل ثقافة العوالق من كل بئر من صفيحة الميكروتيتر إلى سطح لوحة المثقاب LB. ضع ألواح المثقاب LB على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

ثم حدد بصريا الحد الأقصى لنمو البكتيريا على أنه الحد الأدنى من تركيز مبيد للجراثيم لثقافة المضادات الحيوية ، والنوع البري والسلالة الطافرة للبكتيريا لمدة 16 ساعة في وسط غني عند 37 درجة مئوية ، وتخفيف الثقافات المشبعة بين عشية وضحاها من واحد إلى 100 في وسط جديد لمقايسات مقاومة المضادات الحيوية لكل بئر من طبق 96 بئر ميكروتيتر. أضف 90 ميكرولتر من التخفيف البكتيري. الآن لتعريض الخلايا العوالق لتدرج تركيز المضاد الحيوي.

ابدأ ب 10 محاليل مخزون من سلسلة تخفيف من المضادات الحيوية مثل توبرامايسين مايسين. أضف 10 ميكرولتر من سيقان المضادات الحيوية حسب التصميم التجريبي. ثم أضف 10 ميكرولترات من الماء إلى آبار التحكم الخالية من المضادات الحيوية لكل تكرار وسلالة.

احتضان صفيحة الميكروتيتر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية لفحص الخلايا الحية. ابدأ بوضع ملصقات على لوحة مثقاب LB واحدة لكل نصف من لوحة الميكروتيتر 96 Well. تعقيم الجهاز متعدد المحاور عن طريق الاشتعال بالإيثانول بنسبة 100٪.

كرر مرة واحدة. ثم باستخدام الجهاز متعدد الشقوق ، انقل حوالي ثلاثة ميكرولترات من ثقافة العوالق من كل بئر من لوحة الميكروتيتر إلى سطح لوحة المثقاب LB. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

ثم حدد الحد الأدنى من تركيز المضاد الحيوي في مبيد للجراثيم عن طريق تحديد الحد الأقصى لنمو البكتيريا بالعين. في هذه التجربة ، تم استخدام مقايسين مختلفين لتركيز الحد الأدنى من مبيد الجراثيم لمقارنة حساسية النوع البري PA 14 مع سلالة متحولة تفتقر إلى مقاومة المضادات الحيوية. جين NDVB.

هنا ، تم قياس الحد الأدنى من تركيزات مبيد للجراثيم للمضاد الحيوي توبرامايسين للأغشية الحيوية. MBCB ل PA 14 هو 100 ميكروغرام لكل مليلتر مقارنة ب 12.5 ميكروغرام لكل مليلتر للمتحور. على النقيض من ذلك ، كان الحد الأدنى من تركيزات مبيد الجراثيم للتوبرامايسين للخلايا العوالق ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر لكل من النوع البري PA 14 والمتحور.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء NBCB في حوالي ساعة ، مقسمة على خمسة أيام.