يشتغل المغناطيسي النائية متري تحقيقات ل في الموقع رسم الخرائط 3D من البكتيريا بيوفيلم الخصائص الفيزيائية

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء قياسين في C للخصائص الفيزيائية المحلية للأغشية الحيوية البكتيرية على المقياس الميكرومتري. للقيام بذلك ، يتم إدخال الجسيمات المغناطيسية في غشاء حيوي متنامي لتكون بمثابة مجسات يمكن تشغيلها عن بعد دون الإخلال بالخصائص الهيكلية للأغشية الحيوية. ثم يتم استخدام ملاقط مغناطيسية مخصصة لممارسة قوة محددة على كل جسيم.

في جزء لا يتجزأ من فيلم الأغشية الحيوية ، تتم مراقبة إزاحة الجسيمات الناتجة عن السحب المغناطيسي باستخدام الفحص المجهري بالفيديو لاشتقاق المعلمات اللزجة المرنة المحلية وتوفير التوزيع المكاني ثلاثي الأبعاد للخصائص الميكانيكية للأغشية الحيوية. تم الحصول على النتائج التي تظهر عدم التجانس الميكانيكي للأغشية الحيوية للإشريكية القولونية وتعطي أدلة على مكونات الأغشية الحيوية التي تدعم الخصائص الفيزيائية للأغشية الحيوية. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري أو علم البيئة أو الغطاء النباتي الحيوي الكامل ، هي أنها تبلغ عن التوزيع المكاني للخصائص الميكانيكية في الموقع دون الإخلال بالتركيب الأصلي للمادة.

لتحضير الجسيمات المغناطيسية لهذا البروتوكول ، قارورة مخزون الدوامة من جزيئات 2.8 ميكرومتر لتعليقها. ثم انقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي صغير. ثم لغسل الجزيئات ، أضف 190 ميكرولتر من الحد الأدنى من المتوسط وقم بتدوير الأنبوب ، وضعه على رف عينة مغناطيسي ، وانتظر تكوين الحبيبات واستنشاق المحلول الخارق.

كرر خطوة الغسيل هذه مرتين أخريين وأعد تعليق الخرزات في 190 ميكرولتر من الحد الأدنى من المتوسط. بعد ذلك ، أضف 950 ميكرولتر من M 63 B واحد مع 0.4٪ جلوكوز إلى 50 ميكرولتر من محلول الخرزة المغسول لضبط تركيز الجسيمات إلى حوالي 5 ملايين حبة لكل مليلتر. لتحضير القناة ، استخدم قاطع زجاج ماسي لقطع شعيرتين زجاجيتين مربعتين بطول 10 سم للحصول على قطعتين بطول ثمانية سنتيمترات.

باستخدام قاطع الزجاج ، قم بقص شريحة زجاجية إلى نصفين. ثم باستخدام غراء سيانواكريليت سريع المفعول أو غراء فائق ، قم بإرفاق القطعتين الشعريتين بقطعتين من الشرائح الزجاجية كما هو موضح في هذا الرسم التخطيطي. على بعد سنتيمترين مع ارتفاع سنتيمتر واحد على كلا الطرفين ، يقوم بالأوتوكلاف للإعداد بأكمله والأنابيب اللازمة المطلوبة.

لمزيد من اتصال القناة ، اجمع المواد المعقمة التالية تحت غطاء تدفق اللانار. أنابيب وموصلات القناة المثبتة ، مرشحان أو مصائد فقاعات للأطفال. مشابك ، محاقن 30 مليلتر مملوءة ب M 63 B ، 1.4٪ جلوكوز وزجاجة النفايات.

قم بتوصيل الشعيرات الدموية بنفس الطريقة. باستخدام أحد الأنابيب. قم بتوصيل زجاجة النفايات بطرف شعري واحد.

ثم باستخدام موصلات قفل الإغراء كتقاطعات ، قم بتوصيل الطرف الآخر من الشعيرات الدموية بمصيدة الفقاعات محلية الصنع أو اصطياد أحدها واصطياد أحدهما لاصطياد اثنين. ثم قم بتوصيل حقنة واحدة 30 ملليلتر M 63 B بالمصيدة الثانية. بعد ذلك لملء الإعداد ب M 63 B المعقم مع 0.4٪ جلوكوز.

قم بتركيب المحقنة على مضخة الحقنة وقم بتشغيل مضخة الحقنة بمعدل حوالي خمسة ملليلتر في الساعة أعلى من المعدلات التجريبية. تتبع بعناية وإزالة جميع الفقاعات في الدائرة إذا لزم الأمر. افصل الدائرة وأعد توصيلها أثناء محاولة هذا الإجراء.

احرص على إزالة أي فقاعات قبل وعند إدخال خليط جزيئات الخلية في الأنبوب ، فهو يساعد على وضع القمامة فوق الشعيرات الدموية ، وهذا سيساعد على النمو المستمر للأغشية الحيوية. اسمح للوسيط بالتدفق عبر النظام لمدة 10 إلى 15 دقيقة. في غضون ذلك ، في أنبوب الطرد المركزي الصغير ، امزج ملليلتر واحد من المعلق البكتيري بكثافة بصرية 0.5 مع مليلتر واحد من محلول الخرزة المغسول المحضر مسبقا.

قم بإيقاف تشغيل التدفق ، وأعد توصيل الأنبوب ، ثم أغلق المشابك. بعد ذلك ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد بخليط حبة البكتيريا وأدخلها في الشعيرات الدموية. بعد مصيدة الفقاعات محلية الصنع ، انقل الجهاز إلى المجهر هناك.

قم بتثبيت الشعيرات الدموية على مرحلة المجهر وضع حاوية النفايات على مستوى أعلى قليلا. ضع مضخة الحقنة على سطح العمل بجانب المجهر. اسمح للجهاز بالوقوف لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتمكين البكتيريا من الاستقرار والالتصاق بسطح الشعيرات الدموية.

بمجرد أن تلتصق البكتيريا بالشعيرات الدموية ، افتح المشابك واضبط معدل التدفق على مضخة الحقنة وابدأ التدفق. على مدار 24 إلى 48 ساعة ، سيتطور الأغشية الحيوية على السطح الشعري ، ويركز على المستوى السفلي الشعري ويبدأ في تسجيل الفاصل الزمني لصور العينة. عادة ما يبلغ تكرار الاستحواذ البالغ صورتين في الدقيقة بشكل كاف عن نمو الأغشية الحيوية.

يظهر هذا الفيلم المرحلة الأولى من الأغشية الحيوية بعد حقن خليط جسيمات الخلية مباشرة. في الاستحواذ الشعري ، يكون التردد صورة واحدة في الثانية ، ويتم تشغيل الفيلم بمعدل 10 إطارات في الثانية. بعد أربع ساعات من النمو ، تنفصل الجسيمات تدريجيا عن السطح ليتم توزيعها في حجم الأغشية الحيوية.

الأسهم الزرقاء تشير إلى أحداث الانفصال. هنا ، تردد الاستحواذ هو صورتان في الدقيقة ، ويتم تشغيل الفيلم بمعدل 15 إطارا في الثانية. بعد 20 ساعة من النمو ، يمكن مراقبة عشرات الجسيمات الموزعة بالتساوي في مستوى بؤري.

التقاط هذا الفيلم في مستوى متوسط ، 20 ميكرومتر فوق القاع الشعري. تم الحصول على صورتين في الدقيقة. يتم تشغيل الفيلم بمعدل 15 إطارا في الثانية.

بمجرد أن ينمو الأغشية الحيوية المزروعة بالجسيمات المغناطيسية يدويا ، قم بربط الملقط المغناطيسي على مرحلة المجهر. لضمان إنشاء تدرجات المجال المغناطيسي المناسبة في منطقة المراقبة ، تأكد من وضع الملقط كما هو موضح في هذا الرسم البياني حيث تقع منطقة القياس الموضحة باللون الأحمر على بعد 300 ميكرومتر من حواف القطبين الأيمن الأيسر للملاقط على طول المحور Y. يتم وضع الجزء السفلي من الشعيرات الدموية على بعد 200 ميكرومتر أسفل قاع الملقط.

لتحقيق هذه الخطوة ، استخدم التحكم في حركة XY لمرحلة المجهر لإحضار حافة القطب المغناطيسي الأيسر والحافة اليسرى للشعيرات الدموية. في نفس مجال المراقبة ، اضبط موضع العمود على بعد 300 ميكرومتر من حافة الشعيرات الدموية باستخدام الاتصال الهاتفي x لمناور الميكروم الأيسر للملاقط. قم بنفس العملية على الجانب الأيمن.

ثم اضبط موضع الملقط على طول المحور Z فيما يتعلق بالجزء السفلي من الشعيرات الدموية. أولا ، قم بمحاذاة الجزء السفلي من الأعمدة مع الجزء السفلي من الشعيرات الدموية وقم بتحريك القطبين. 200 ميكرومتر لأعلى.

باستخدام الاتصال الهاتفي Z للمناور الصغير ، اضبط معلمات مولد الوظائف على 24 ثانية من إشارة الصفر و 16 ثانية من أربعة أمبير. تيار مباشر مع مشغل. أرسل إلى مصراع ضوء المجال الساطع بعد 20 ثانية.

لمزامنة الإشارة ، قم بتوصيل الملقط بمولد الوظائف عبر مضخم الطاقة. انتبه لتوصيل القطبين بشكل صحيح في سلسلة للحصول على منحنيات زحف موزعة مكانيا. خذ أصلا مكانيا ، خذ أصل المحور Z في الجزء السفلي الداخلي من الشعيرات الدموية.

قم بتدوين موضع التحكم في المجهر Z. ثم حدد موقع تقاطع المحور x و Y ، والتي يتم تحديدها بواسطة حافة الشعيرات الدموية وحافة قطعة القطب على التوالي. هذا هو أصل التحليل.

قم بتدوين الإحداثيات. سيتم أخذ جميع الإحداثيات فيما يتعلق بهذا الأصل في ما يلي. بمجرد نمو الأغشية الحيوية ، باستخدام مقبض التحكم في التركيز الدقيق ، اضبط الوضع الرأسي للشعيرات الدموية بحيث يكون المستوى الأول موجودا من أربعة إلى سبعة ميكرومترات فوق القاع الشعري.

تتوافق هذه الشريحة مع شريحة الأغشية الحيوية التي يوجد فيها أصل المرجع المكاني في الزاوية اليسرى العليا. ثم قم بتشغيل المولد الحالي وقم بتشغيل تسلسل الحصول على الصور يدويا. لبدء التسلسل 42 للأحداث ، يتوافق دفق الصورة المأخوذ هنا مع مستوى معين وحقل XY.

بعد التقاط التسلسل، حرك الشعيرات الدموية لالتقاط فيديو للحقل الجديد. استمر في تكرار هذه العملية للحصول على جميع مقاطع الفيديو المطلوبة لتحليل البيانات. افتح الصور في الصورة J أو برنامج تتبع الجسيمات المكافئ لجميع المكدسات المكتسبة في جميع الجسيمات.

قم بتحويل الصور إلى ملفات نصية عن طريق تتبع إزاحة الجسيمات. بعد ذلك ، باستخدام برنامج معالجة البيانات ، ارسم منحنيات الإزاحة وقم بتحويل منحنيات الإزاحة إلى منحنيات امتثال يتم فيها حساب الامتثال الكلي للمادة JFT كدالة للوقت وفقا لصيغة الامتثال الموضحة هنا ، تصف هذه الصيغة العلاقة بين الإجهاد المطبق والإجهاد المادي لجسيم تاريخي من اللون الأحمر ، أو جزءا لا يتجزأ من الوسط اللزج المرن وغير القابل للانضغاط كما تم إنشاؤه سابقا ، وزملاؤه في العمل من تعديل منحنى الامتثال للزحف إلى نموذج البرغر العام للمواد اللزجة المرنة ، اشتقاق المعلمات اللزجة المرنة J صفر J واحد عند الصفر عند العدد الأولي الواحد لتوفير التوزيع المكاني للخصائص اللزجة المرنة لمنحنيات زحف الأغشية الحيوية التي تم جمعها على أعماق مختلفة في حجم صغير للأغشية الحيوية يبلغ حوالي 200 بواسطة 200 × 40 ميكرومتر مكعب. النتائج النموذجية موضحة هنا.

يتم إعطاء قيم J صفر ، الامتثال المرن كدالة للمحور Z على طول العمق والمحور y على طول البعد الجانبي للأغشية الحيوية. تتوافق كل نقطة مع حبة قدم لها تحليل منحنى الزحف قيمة J صفر. تكشف البيانات أن الامتثال المحلي يختلف على طول عمق الأغشية الحيوية على ما يقرب من ثلاثة أوامر من حيث الحجم.

أيضا ، حدث عدم تجانس جانبي قوي في جميع ارتفاعات الأغشية الحيوية. توفر البيانات أيضا توزيع قيم الامتثال ، والتي تظهر شكلا واسع النطاق وغير متماثل. تشير مقارنة هذه النتائج بتلك التي تم الحصول عليها سابقا على البوليمرات البيولوجية الأخرى إلى أن الخصائص الميكانيكية للأغشية الحيوية مدعومة بمواد هلامية بوليمر متشابكة للغاية.

في C اثنين من القياسات للأغشية الحيوية ، تم إجراء الخصائص المحلية أيضا في ظل ظروف بيئية مختلفة ، مثل معدل التدفق المنخفض كما يمكن رؤيته هنا. لا تزال قيم الامتثال للأغشية الحيوية التي تنمو بسرعة 0.1 مليلتر في الساعة تظهر مظهرا ميكانيكيا غير متجانس للغاية. لكن الاعتماد الواضح على عمق Z لصلابة الأغشية الحيوية التي لوحظت في الأغشية الحيوية التي نمت بمعدل واحد مليلتر في الساعة قد اختفى.

توضح هذه النتائج التأثير الكبير للظروف الخارجية على تنظيم الأغشية الحيوية مشاهدة الفيديو. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية رسم خريطة لخصائص فيسكو لمعهد بيوفيلم في ظل ظروف نمو خاضعة للرقابة الكاملة.