يشتغل المغناطيسي النائية متري تحقيقات ل

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء قياسين في C للخصائص الفيزيائية المحلية لغشاء حيوي بكتيري (biofilm) على المقياس الميكرومتري. ولتحقيق ذلك، يتم إدخال جسيمات مغناطيسية في غشاء حيوي نامٍ لتعمل كمجسات يمكن تحريكها عن بُعد دون تعكير الخصائص الهيكلية للغشاء الحيوي. ثم تُستخدم ملاقط مغناطيسية مخصصة لتسليط قوة محددة على كل جسيم.

عندما تكون الجسيمات مدمجة في الغشاء الحيوي، يتمت مراقبة إزاحة الجسيمات الناتجة عن السحب المغناطيسي باستخدام المجهر الفيديوِي لاستخلاص المعاملات اللزوجية المرنة المحلية وتوفير التوزيع المكاني ثلاثي الأبعاد للخصائص الميكانيكية للغشاء الحيوي. وقد تم الحصول على نتائج تُظهر التباين الميكانيكي للغشاء الحيوي لبكتيريا e coli وتقدم مؤشرات حول مكونات الغشاء الحيوي التي تدعم خصائصه الفيزيائية. وبناءً على ذلك، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهرية، أو علم التصنيف، أو الزرع الحيوي الكامل، هي أنها ترصد التوزيع المكاني للخصائص الميكانيكية في الموقع دون المساس بالبنية الأصلية للمادة.

لتحضير الجسيمات المغناطيسية لهذا البروتوكول، قم برج أنبوب المخزون الذي يحتوي على جسيمات بحجم 2.8 micrometer باستخدام جهاز vortex لإعادة تعليقها. ثم انقل 10 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. ولغسل الجسيمات، أضف 190 µL من الوسط الأدنى (minimum medium) وقم بتدوير الأنبوب، ثم ضعه على حامل عينات مغناطيسي، وانتظر حتى تتكون كتل جسيمات (pellet)، ثم اسحب السائل الطافي.

كرر خطوة الغسل هذه مرتين إضافيتين وأعد تعليق الخرزات في 190 µL من الوسط الأدنى. بعد ذلك، أضف 950 µL من M 63 B one الذي يحتوي على 0.4% glucose إلى 50 µL من محلول الخرزات المغسولة لضبط تركيز الجسيمات ليكون حوالي 5 مليون خرزة لكل mL. لتحضير القناة، استخدم قاطع زجاج ماسي لقطع أنبوبين شعريين من زجاج البوروسيليكات المربع بطول 10 cm للحصول على قطعتين بطول 8 cm لكل منهما.

باستخدام قاطع الزجاج، اقطع شريحة زجاجية إلى نصفين. ثم باستخدام غراء سيانوأكريليت سريع المفعول أو غراء فائق (super glue)، قم بتثبيت القطعتين الشعيريتين على قطعتي الشريحة الزجاجية كما هو موضح في هذا المخطط. مع ترك مسافة 2 cm بينهما وبروز 1 cm عند كل طرف، قم بتعقيم التجهيزة كاملة مع الأنابيب اللازمة باستخدام الموصدة (autoclave).

لإتمام توصيل القنوات، اجمع المواد المعقمة التالية تحت غطاء تدفق صفائحي: أنابيب القنوات والموصلات المثبتة، ومرشحان أو مصيدتان للفقاعات مخصصتان للأطفال، ومشبكان، وحقن سعة 30 milliliter مملوءة بـ M 63 B و 1.4%glucose، وزجاجة النفايات.

قم بتوصيل الشعريتين بنفس الطريقة. وباستخدام أحد الأنابيب، قم بتوصيل زجاجة النفايات بأحد طرفي الشعيرة.

ثم باستخدام وصلات القفل اللولبي (lure lock) كروابط، قم بتوصيل الطرف الآخر من الشعيرة الدموية بمصيدة الفقاعات المصنعة منزلياً، أو قم بتوصيل المصيدة الأولى بالمصيدة الثانية. بعد ذلك، قم بتوصيل حقنة M 63 B one سعة 30 milliliter بالمصيدة الثانية. تلي ذلك خطوة ملء التجهيزات بمحلول M 63 B one معقم يحتوي على 0.4%glucose.

ثبّت المحقنة في مضخة المحاقن وقم بتشغيل المضخة بمعدل يزيد بنحو 5 mL/h عن المعدلات التجريبية. تتبع جميع الفقاعات الموجودة في الدائرة بدقة وقم بإزالتها إذا لزم الأمر، وذلك عن طريق فصل الدائرة وإعادة توصيلها أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

احرص على إزالة أي فقاعات قبل وأثناء إدخال خليط الخلايا والجزيئات في الأنابيب، ومن المفيد وضع خزان النفايات فوق الشعيرات، حيث سيساعد ذلك في النمو المستمر للغشاء الحيوي. اترك الوسط يتدفق عبر النظام لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. وفي هذه الأثناء، في أنبوب طرد مركزي دقيق، اخلط 1 mL من المعلق البكتيري بكثافة ضوئية 0.5 مع 1 mL من محلول الخرز المغسول الذي تم تحضيره مسبقاً.

أوقف التدفق، وأعد توصيل الأنابيب، ثم أغلق المشابك. بعد ذلك، املأ حقنة سعة 1 mL من خليط حبيبات البكتيريا وأدخلها في الشعيرة الدموية. بعد مصيدة الفقاعات المنزلية، انقل الجهاز إلى المجهر هناك.

قم بتركيب الشعيرة على منصة المجهر وضع حاوية النفايات عند مستوى أعلى قليلاً. ضع مضخة السرنجة على سطح العمل بجانب المجهر. اترك الجهاز لمدة 15 إلى 20 دقيقة للسماح للبكتيريا بالترسب والالتصاق بسطح الشعيرة.

بمجرد التصاق البكتيريا بالشعيرة، افتح المشابك واضبط معدل التدفق في مضخة السرنجة ثم ابدأ التدفق. على مدار 24 إلى 48 ساعة، سيتكون غشاء حيوي (biofilm) على سطح الشعيرة؛ ركز على المستوى السفلي للشعيرة وابدأ تسجيل الصور المقطعية للعينات بفاصل زمني. عادةً ما يكون تردد الاستحواذ بمعدل صورتين في الدقيقة كافياً لرصد نمو الغشاء الحيوي.

يعرض هذا المقطع المرحلة الأولية للغشاء الحيوي (biofilm) مباشرة بعد حقن خليط الجزيئات الخلوية. في عملية الالتقاط الشعيري، يبلغ التردد صورة واحدة في الثانية، ويتم تشغيل المقطع بمعدل 10 إطارات في الثانية. وبعد أربع ساعات من النمو، انفصلت الجزيئات تدريجياً عن السطح لتتوزع داخل حجم الغشاء الحيوي.

تشير السهام الزرقاء إلى أحداث الانفصال. تبلغ ترددات الالتقاط هنا صورتين في الدقيقة، ويتم تشغيل المقطع بمعدل 15 إطاراً في الثانية. وبعد 20 ساعة من النمو، يمكن مراقبة اثني عشر جسيماً موزعة بالتساوي في مستوى بؤري.

تم تصوير هذا المقطع في المستوى المتوسط، على ارتفاع 20 micrometers فوق قاع الشعيرة. تم التقاط صورتين في الدقيقة الواحدة، ويتم عرض المقطع بمعدل 15 إطاراً في الثانية.

بمجرد نمو الغشاء الحيوي الملقح بالجسيمات المغناطيسية يدوياً، قم بتثبيت الملاقط المغناطيسية على منصة المجهر. ولضمان توليد تدرجات المجال المغناطيسي المناسبة في منطقة المراقبة، تأكد من وضع الملاقط كما هو موضح في هذا المخطط، حيث تقع منطقة القياس الموضحة باللون الأحمر على مسافة 300 micrometers من حواف القطبين الأيمن والأيسر للملاقط على طول المحور Y. ويتم وضع الجزء السفلي من الأنبوب الشعري على مسافة 200 micrometers أسفل قاعدة الملاقط.

لإتمام هذه الخطوة، استخدم تحكم الحركة XY لمنصة المجهر لتقريب حافة القطب المغناطيسي الأيسر من الحافة اليسرى للأنبوبة الشعرية. وفي نفس مجال الرؤية، اضبط موضع القطب ليكون على بُعد 300 micrometers من حافة الأنبوبة الشعرية باستخدام قرص x للمناور المجهري الأيسر للملاقط. كرر العملية ذاتها على الجانب الأيمن.

بعد ذلك، قم بضبط موضع الملاقط على طول المحور Z بالنسبة لقاع الشعيرة الدموية. أولاً، قم بمحاذاة الجزء السفلي من الأقطاب مع قاع الشعيرة الدموية، ثم حرك الأقطاب للأعلى بمقدار 200 micrometers.

باستخدام قرص Z للمتحكم الدقيق، اضبط معلمات مولد الدوال على 24 ثانية من الإشارة الصفرية و16 ثانية من أربعة أمبيرات. تيار مستمر مع مشغل. يتم الإرسال إلى غالق ضوء المجال المضيء بعد 20 ثانية.

لمزامنة الإشارة، قم بتوصيل الملاقط بمولد الدوال عبر مضخم القدرة. احرص على توصيل الأقطاب على التوالي بشكل صحيح للحصول على منحنيات زحف موزعة مكانيًا. حدد نقطة أصل مكانية، واجعل نقطة الأصل للمحور Z عند القاع الداخلي للشعيرية.

سجِّل وضع التحكم في المحور Z للمجهر. ثم حدد نقطة تقاطع المحورين x و Y، واللذين يتم تحديدهما بواسطة حافة الشعيرة وحافة القطعة القطبية على التوالي. هذه النقطة هي نقطة بداية التحليل.

دوّن الإحداثيات. ستُؤخذ جميع الإحداثيات لاحقاً بالنسبة إلى نقطة الأصل هذه. بمجرد نمو الغشاء الحيوي، استخدم مقبض ضبط التركيز الدقيق لتعديل الموضع الرأسي للأنبوب الشعري بحيث يقع المستوى الأول على مسافة تتراوح بين 4 إلى 7 µm فوق قاع الأنبوب الشعري.

تقابل هذه الشريحة شريحة الغشاء الحيوي (biofilm) حيث تقع نقطة أصل المرجع المكاني في الزاوية العلوية اليسرى. ثم قم بتشغيل مولد التيار وقم بتفعيل تسلسل التقاط الصور يدويًا. لبدء التسلسل الثاني والأربعين من الأحداث، فإن تدفق الصور المكتسبة هنا يقابل مستوى وحقل XY محددين.

بعد التقاط التسلسل، حرك الشعيرية لتصوير مقطع فيديو للمجال الجديد. استمر في تكرار هذه العملية للحصول على جميع مقاطع الفيديو المطلوبة لتحليل البيانات. افتح الصور في برنامج image J أو أي برنامج مكافئ لتتبع الجسيمات لجميع المجموعات التي تم الحصول عليها لجميع الجسيمات.

قم بتحويل الصور إلى ملفات نصية من خلال تتبع إزاحة الجسيمات. بعد ذلك، وباستخدام برنامج لمعالجة البيانات، ارسم منحنيات الإزاحة وقم بتحويلها إلى منحنيات امتثال، حيث يتم حساب الامتثال الكلي للمادة JFT كدالة في الزمن وفقاً لصيغة الامتثال الموضحة هنا. تصف هذه الصيغة العلاقة بين الإجهاد المطبق وانفعال المادة لجسيم تاريخي من الكرات، أو المدمج في وسط لزج مرن وغير قابل للانضغاط كما تم إثباته سابقاً من قبل الباحث وزملائه. ومن خلال مطابقة منحنى امتثال الزحف مع نموذج "برجرز" العام للمواد اللزجة المرنة، يتم اشتقاق المعاملات اللزجة المرنة J zero J one at the zero at the one prime لتوفير التوزيع المكاني للخصائص اللزجة المرنة للغشاء الحيوي. تم جمع منحنيات الزحف عند أعماق مختلفة في حجم ميكروي من الغشاء الحيوي يبلغ تقريباً 200 by 200 by 40 cubic micrometers. والنتائج النموذجية موضح هنا.

تُعرض قيم J zero، وهي الامتثال المرن، كدالة للمحور Z على طول العمق والمحور y على طول البعد الجانبي للغشاء الحيوي الرقيق. تقابل كل نقطة حبيبة قدم تحليل منحنى الزحف لها قيمة J zero. وتكشف البيانات أن الامتثال المحلي يتفاوت على طول عمق الغشاء الحيوي الرقيق عبر ما يقرب من ثلاثة رتب مقدارية.

علاوة على ذلك، حدث تباين جانبي قوي عند جميع ارتفاعات الغشاء الحيوي. كما توفر البيانات توزيع قيم الامتثال، والتي تظهر شكلاً واسع النطاق وغير متماثل. وتشير مقارنة هذه النتائج بالنتائج التي تم الحصول عليها سابقاً على بوليمرات بيولوجية أخرى إلى أن الخصائص الميكانيكية للغشاء الحيوي مدعومة بهلامات بوليمرية عالية التشابك.

في الجزء C، أُجري قياسان للخصائص المحلية للغشاء الحيوي (biofilm) تحت ظروف بيئية مختلفة، مثل معدل تدفق أقل كما هو موضح هنا. ولا تزال قيم الامتثال للغشاء الحيوي الذي تمت زراعته بمعدل 0.1 milliliter per hour تظهر ملفاً ميكانيكياً غير متجانس للغاية. ولكن الاعتماد الواضح لصلابة الغشاء الحيوي على العمق Z الذي لوحظ في الغشاء الحيوي المزروع بمعدل one milliliter per hour قد اختفى.

توضح هذه النتائج التأثير الكبير للظروف الخارجية على تنظيم الغشاء الحيوي. من خلال مشاهدة الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية رسم خرائط الخصائص اللزوجية للغشاء الحيوي تحت ظروف نمو خاضعة للتحكم الكامل.