تحريض الغازية سرطان المثانة الانتقالية الخليوي في المناعة السليمة الإنسان MUC1 الفئران المعدلة وراثيا: نموذج للتنمية الخلايا الجذعية

الهدف العام من التجربة التالية هو إحداث استجابة الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا بشكل فعال والتي تستهدف مستضد مرتبط بالورم في سرطان المثانة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إحداث سرطان المثانة في الفئران التي تعبر عن المستضد البشري المرتبط بالورم ماخ واحد. بعد ذلك ، يتم حقن لقاح الببتيد في الفئران ويتم إنشاء استجابة الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا من ماخ واحد.

ثم يتم عزل ورم المصل والطحال وتحليل الأنسجة بحثا عن السيتوكينات والمستضدات والاستجابة المناعية على التوالي. يتيح لنا استخدام اللطخة الغربية متعددة الإرسال ، والميكروبياض المتري الفلوري ، والكيمياء المناعية للمقايسة المناعية ، وتحليل البقع الحية اختبار فعالية لقاح الببتيد ضد سرطان المثانة. مرحبا ، أنا الدكتور جريجوري ويتز ، عالم أبحاث في نظام ديفيس الصحي بجامعة كاليفورنيا في ساكرامنتو ، كاليفورنيا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الطعوم الغريبة ، هي أن الطعوم الغريبة تتطلب مضيفين يعانون من نقص المناعة ، في حين أن نموذجنا يستخدم فأرا معدلا وراثيا سليما للمناعة يعبر عن مستضد مرتبط بالورم البشري وهو هدف لقاح الببتيد. سيظهر التقنيات معي دانيال الخامس والأطباء شاجا وأودري جوتيريز ، وجميعهم من زملائهم من علماء الأبحاث ، ومختبر الدكتور مايكل دي جريجوريو ونظام جامعة كاليفورنيا في ديفيس الصحي. قبل إعطاء الجرعة الأولى من N butyl أو N four hydroxy أو بوتيل نيتروزامين أو O-H-B-B-N للحث على سرطان المثانة ، قم بإجراء نزيف تحت الفك السفلي على كل فأر لجمع الدم الكامل وأنابيب تخثر الدم والسماح ب 30 دقيقة حتى يتجلط الدم.

بدءا من ثمانية أسابيع باستخدام إبر تزقيم قياس 20 من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بإدارة O-H-V-B-N عن طريق الفم خمسة أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا. في الأسبوع 20 ، استخدم 600 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ لإعادة تكوين كل قارورة من لقاح الببتيد المجفف بالتجميد وإعادة تعليقه تماما عن طريق سحب المحلول من خلال إبرة قياس 0.5 بوصة 27 ست مرات باستخدام محلول ملحي. ضبط التركيز بحيث يتم توصيل الجرعة المطلوبة بحجم 100 ميكرولتر بعد الجرعة الأخيرة من O-H-B-B-N وإعطاء اللقاح على أساس أسبوعي لمدة ثمانية أسابيع باستخدام إبرة قياس 25 لحقن 100 ميكرولتر من اللقاح بعد ثمانية أسابيع من الجرعة الأخيرة من O-H-B-B-N.

بعد القتل الرحيم لجميع الفئران عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون ، ضع كل فأر على لوح تشريح وقم بتثبيت جميع الأطراف الأربعة. بعد ذلك ، باستخدام الملقط والمقص ، قم بعمل شق أفقي في منطقة البطن العلوية. أدخل المقص في الشق بين طبقة البشرة وجدار البطن ، وبمساعدة الملقط ، افصل الجلد برفق عن الأنسجة الأساسية.

قم بعمل شق رأسي من الشق الأفقي الذي يتبع المحور الأوسط باتجاه الطرف الأمامي للماوس. ثم افصل الجلد عن القفص الصدري وباستخدام حقنة سعة مليلتر واحد وإبرة قياس 22 ، قم بثقب القلب وجمع الدم بسحب سلس وثابت باستخدام ملقط ومقص. قم بقص وتقشير بقية طبقة البشرة داخل خزانة السلامة البيولوجية.

قطع من خلال جدار البطن والصفاق والتعقيم. إزالة ورم المثانة للكيمياء المناعية أو IHC واللطخة الغربية ل IHC. ضع عينة ورم المثانة في كاسيت مناديل وقم بإصلاحها في شكل مبرد طوال الليل.

في درجة حرارة الغرفة ، اجمع الطحال لتحليل بقاء الخلية وبقعة الاستلقاء لإجراء المقايسة المناعية للميكروب المتري الفلوري متعدد الإرسال. استخدم 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص للبلل مسبقا. لوحة سفلية للمرشح 96 جيدا ، مما يسمح للمرشح بالنقع تماما.

ثم استخدم جهاز تفريغ 96 لوح بئر لتصريف الفلتر برفق واستخدام المناشف الورقية لتجفيف الجزء السفلي من اللوحة بالدم باستخدام ماصة ماصة متعددة القنوات 25 ميكرولترا من مصفوفة المصل في الآبار المخصصة للفراغات والمعايير والماصة 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص في الآبار المخصصة للضوابط والمجهولة. بعد ذلك ، قم بتعبئة 25 ميكرولترا من المعايير الفارغة والضوابط والمجهول للآبار المخصصة المعنية. دوامة مزيج الخرزة لمدة 20 ثانية وانقل الخرز إلى خزان.

ثم ماصة 25 ميكرولترا من مزيج الخرزة في كل منها. قم بتغطية اللوحة جيدا لحمايتها من الضوء ورج اللوحة على شاكر بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم صفي الطبق واستخدم 200 ميكرولتر من PBST لغسله مرتين قبل تجفيفه وتجفيفه. لتحضير محلول الأجسام المضادة للكشف ، اجمع بين الكمية المطلوبة من 0.1٪ PBST والجسم المضاد للكشف في أنبوب 15 مليلتر ودوامة لمدة 10 ثوان.

ثم ماصة 25 ميكرولتر في كل منها. حسنا ، رج الطبق عند 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم صفي الطبق واغسله ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBST مرتين ، قم بتصريف الماصة الجافة 25 ميكرولترا من البكتيريا العقدية المحضرة حديثا ، AVID و FICO eryn أو SAPE لكل منها ، ضع اللوحة جيدا على شاكر اللوحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عند 500 دورة في الدقيقة.

يصفى ويغسل باستخدام PBST مرتين. لتعليق الخرزات ، أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBST إلى كل بئر ورجه عند 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين على الأقل. استخدم آلة Luminex LX 200 لقراءة وتحليل اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية.

قم بمعالجة طحال الفأر من خلال مناخل أنسجة النايلون 100 ميكرومتر إلى خمسة ملليلتر من PBS المعقمة في أطباق بتري المعقمة. ضع طبقة من PLE على ثلاثة ملليلتر من وسط فصل الخلايا الليمفاوية في أنابيب معقمة سعة 15 مل. الطرد المركزي الأنابيب عند 600 GS لمدة 15 دقيقة.

لفصل الخلايا الليمفاوية عن خلايا الدم الحمراء ، قم بنقل الخلايا الليمفاوية ذات الطبقات فوق التدرج إلى أنابيب جديدة معقمة سعة 15 مليلتر في أنابيب طرد مركزي ذات غطاء لولبي سعة 1.5 ملليلتر. استخدم كاشف صلاحية العد لعمل تخفيف تسلسلي للخلايا الليمفاوية. ثم حلل على الملهمة.

قم بإعداد خريطة لوحة للعينات والظروف للوحة بقعة الحليف عن طريق تحضير اللوحة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والماصة 100 ميكرولتر من الببتيد المتوسط أو الببتيد المتدافع في كل منها. حسنا ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لمقايسة ALI الموضعية واستخدم مجهر التشريح لتحليل لوحة Aly الموضعية.

حدد النتائج عن طريق حساب عدد البقع الملونة المقابلة لكل مادة تحليلية في كل بئر. تتوافق البقع مع عدد الخلايا المكونة للبقع في كل بئر في تحريض نموذج الفأر المعدل وراثيا مع مادة مسرطنة كيميائية. أدى O-H-B-B-N إلى ارتفاع معدل حوادث سرطان المثانة لسرطان الخلايا الانتقالية في الغالب أو TCC مع بعض سرطان الخلايا الحرشفية أو SCC ، والذي يشبه سرطان المثانة لدى البشر كما هو موضح في هذا الشكل.

بعد ثمانية أسابيع من تحريض O-H-B-B-N كان معدل الإصابة بسرطان المثانة لكل من الفئران المعدلة وراثيا أو TG والفئران البرية 67٪ أكد تلطيخ الهيماتين وطلاء اليوزين وجود كل من TCCs و SCCs مع TCCs السائدة بنسبة اثنين إلى واحد. من بين هؤلاء ، لاحظنا مجموعة من الأورام الغازية منخفضة وعالية الجودة غير الغازية إلى عالية الدرجة. كانت جميع عينات سرطان المثانة ماخ واحد إيجابية لتعبير ماخ واحد بواسطة IHC.

أثناء تطوير النموذج ، تمت مراقبة مستويات السيتوكينات الالتهابية في المصل بشكل متسلسل بين الأسابيع الثامنة إلى 28. لاحظنا أن مستويات السيتوكين الالتهابي زادت بمرور الوقت من الحث حتى نهاية الدراسة. يشبه نمط السيتوكين هذا إلى حد بعيد ما لاحظناه سابقا في نموذج سرطان الرئة الخاص بنا ، مما يشير بقوة إلى أن زيادة مستويات السيتوكين الالتهابي قد ترتبط بتطور الورم.

لتقييم استجابة السيتوكين المصلي للقاح الببتيد ، تم القتل الرحيم ل 15 فأر ملقح و 14 معالجا بالدواء الوهمي ، وتم جمع الدم في نهاية الدراسة. بعد 24 ساعة من آخر علاج للقاح. يظهر تحليل تعدد الإرسال زيادة في مستويات السيتوكين في مصل الدم من عامل نخر الورم ألفا إنترفيرون جاما IL اثنين IL 12 و IL 17 في مجموعة اللقاح.

بالمقارنة مع مجموعة الدواء الوهمي ، كانت مستويات عامل نخر الورم ألفا إنترفيرون جاما و IL 17 أعلى بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة باللقاح. تشير هذه النتائج إلى استجابة السيتوكين المستقطبة للقاح الببتيد من أجل تقييم الاستجابة المناعية TH واحد ، TH اثنين للقاح الببتيد. تم تقييم خلايا SP بواسطة إنترفيرون جاما IL أربعة بقعة ALI الموضحة هنا هي تقييم للخلايا الليمفاوية المعزولة للبقاء بعد بذر صفائح بقعة ALI مع الخلايا الليمفاوية القابلة للحياة ، وكانت النتائج في هذه التجربة استجابة واضحة ومحددة للإنترفيرون جاما للببتيد ، مما يؤكد الاستجابة المناعية TH واحد للقاح الببتيد بعد تطويره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مناعة السرطان لاستكشاف علاجات مناعية جديدة باستخدام نموذج قبل السريري لسرطان المثانة المتقدم.