Name: التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: اكتشف طريقة سريعة لتوليد ألياف الأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر باستخدام درجات حرارة مرتفعة وروابط EDC الكيميائية. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة آليات تكوّن الأميلويد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل مدعوم بمنح لمرحاض المياه من AI074809 منح المعاهد الوطنية للصحة وبرنامج منح الأبحاث المؤسسية لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس.

1. إعداد MES Buffer
<ol>
	<li>استخدم المخزن المؤقت MES (0.1 M 2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك و 0.9 M كلوريد الصوديوم) لتحضير كل من الأميلويد الذي يحتوي على البروتين فقط بالإضافة إلى قلة البروتين القابلة للذوبان المستقرة. تزن 1.95 جم من MES و 5.27 جم من كلوريد الصوديوم. أضف H2O واضبط الرقم الهيدروجيني على 4.7. اصنع الحجم النهائي إلى 100 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.</li>
</ol>
2. تحضير الأميلويد البروتيني فقط مباشرة من البروتينات الأصلية
<ol>
	<li>قم بوزن البروتين المفضل (أي بروتين أو ببتيد أصلي) وأعد تشكيله إلى 10 مجم / مل في مخزن MES المؤقت.</li>
	<li>احتضن عند 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 4 ساعات. بحلول نهاية الفترة ، يكون الراسب الأبيض مرئيا في المحلول.</li>
	<li>قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ (حجم / حجم) من Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 10.5).</li>
	<li>غسيل الكلى بالبروتين في شريط غسيل الكلى طوال الليل لاستبداله إلى المخزن المؤقت المطلوب لمزيد من التحليل.</li>
	<li>يمكن تحضير عينة تحكم من البروتين الأصلي باتباع الخطوات 2.1 و 2.3 و 2.4 بدون هطول الأمطار الحرارية (الخطوة 2.2).</li>
</ol>
فئة 3. تحضير الأميلويد الهجين من أوليغومرات قابلة للذوبان المستقرة للبروتينات الأصلية
<ol>
	<li>تحضير قلة البروتين القابلة للذوبان المستقرة
	<ol>
		<li>قم بوزن البروتين المفضل وأعد تكوينه إلى 10 مجم / مل في المخزن المؤقت MES. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>قم بوزن 1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) وقم بإعداد مخزون جديد من 20 مجم / مل في مخزن MES المؤقت.</li>
		<li>امزج محاليل البروتين و EDC بنسبة 2: 5 (حجم / حجم) ، أي 2 مجم من البروتين لكل 10 مجم من EDC.</li>
		<li>احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.</li>
		<li>قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ (حجم / حجم) من Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 10.5).</li>
		<li>غسيل الكلى بالبروتين في شريط غسيل الكلى طوال الليل لاستبداله إلى المخزن المؤقت المطلوب لمزيد من التحليل.</li>
		<li>قم بتخزين البروتين القابل للذوبان المستقر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحضير الأميلويد الهجين من قليل البروتين القابل للذوبان المستقر.
	<ol>
		<li>لتحضير الأميلويد المحتوي على الحمض النووي ، امزج الحمض النووي وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.</li>
		<li>لتحضير الأميلويد المحتوي على الحمض النووي الريبي ، امزج الحمض النووي الريبي وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.</li>
		<li>لتحضير الأميلويد المحتوي على الهيبارين ، اخلطي الهيبارين وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

ليس لدينا ما نكشف عنه.

توفر الطريقة الموضحة هنا وسيلة سريعة ومرنة لتحضير ألياف الأميلويد في المختبر من أي بروتين أو ببتيد من اختياره. يمكن تحضير عدة أنواع مختلفة من الأميلويد بشكل موثوق - ألياف البروتين فقط أو المجاميع الهجينة التي تحتوي على الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الجليكوزامينوجليكان. الإجراءات المتبعة بسيطة ومباشرة ولا تتطلب تدريبا تقنيا متقدما. الأميلويد المحضر بهذه الطريقة مستقر تماما ويمكن تخزينه بأمان عند 4 درجات مئوية أو تجميده عند -80 درجة مئوية لفترة أطول.
أحد أهم العوامل لضمان التول...

البروتينات هي أكثر الجزيئات البيولوجية وفرة الموجودة في جميع أنواع الخلايا. تحدث في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأحجام والهياكل والتعديلات اللاحقة للترجمة ، وتؤدي مجموعة هائلة من الوظائف البيولوجية المهمة عندما تكون في أشكالها الأصلية. أكثر من عشرين من عديد الببتيدات الشاذة متورطة في العديد من الحالات المرضية البشرية ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض السكري من النوع 21-4. تتراكم البروتينات الطرفية غير المطوية على شكل ألياف أميلويد ، وهي المجاميع المستقرة غير القابلة للذوبان التي تحدث خارج الخلية أو داخل الخلية.
 على الرغم من الآثار المترتبة على بروتينات معينة في بعض الأمراض ، فإن الأدلة المتزايدة تدعم فكرة أن جميع عديد الببتيدات لها خصائص جوهرية تمكن من تحويل الأميلويد. حدد مسح التسلسل على مستوى الجينوم "الأميلوم" ، والذي تشكل من خلاله الشظايا المعرضة للأميلويد ما يقرب من 15٪ من جميع أجزاء الببتيد المشفرة من الإشريكية القولونية إلى البشر5. وفقا لذلك ، تم اكتشاف عدد متزايد من الأميلويدات الوظيفية ، التي تشارك في العديد من العمليات الخلوية المهمة ، في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال ، تقوم البكتيريا بتجميع الأميلويد لتشكيل هياكل الأغشية الحيوية والأبواغ التي تعتبر ضرورية لبقائها وإمراضها6-9. تشكل هرمونات الببتيد رواسب أميلويد أثناء التخزين داخل حبيبات إفرازية الثدييات قبل إطلاقها ، مما يعني أيضا أن شكل البروتين النشواني يمكن أن يخدم وظائف بيولوجية مفيدة6،10،11. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتجمع البروتينات أيضا في ألياف الأميلويد لنقل الإشارات الخلوية الحرجة12،13.
لسنوات عديدة ، يتم تحضير الأميلويد الأكثر دراسة من الببتيدات الفردية المرتبطة بالأمراض البشرية ، مثل أميلويد بيتا أو ببتيد البريون. عادة ما تفتقر هذه الببتيدات إلى بنية محددة جيدا وتشكل الأميلويد تلقائيا في المحلول بمرور الوقت ، وهي عملية بوساطة وسيط غير مطوي جزئيا يعمل كمقدمة للأميلويد غير القابل للذوبان. تسمى مقدمة الأميلويد أيضا بقليل البروتين القابل للذوبان ، وهو نادر وغير مستقر عند إنشاؤه من الببتيدات الطبيعية14،15. ومع ذلك ، كما هو موضح سابقا ، يمكن لأي بروتين تقريبا من حيث المبدأ أن يتبنى تشكل الأميلويد في ظل الظروف المناسبة. لقد أنشأنا مؤخرا طريقة لتحضير أوليغومرات قابلة للذوبان مستقرة من البروتينات الأصلية ، والتي تشكل الأميلويد بسهولة في وجود عوامل مساعدة مختلفة16. تعكس ألياف الأميلويد الناتجة الطبيعة المعقدة لمجاميع البروتين الطرفي غير القابلةللطي 17،18. نستخدم هنا مصطلح الأميلويد البروتيني فقط لإحالة ألياف البروتين بدون عوامل مساعدة والأميلويد الهجين للألياف التي تحتوي على مكونات غير بروتينية
 في السابق ، تم تطوير طرق مختلفة لتوليد الأميلويد في المختبر من خلال تطبيق ظروف معروفة بأنها تفضل طي البروتين بشكل خاطئ ، مثل ارتفاع درجة الحرارة ، والبيئة الكارهة للماء ، وتغيرات الأس الهيدروجيني19-23. ومع ذلك ، فإنها ترتبط بمشاكل مختلفة ، مثل الكفاءة المنخفضة أو الطي القابل للانعكاس أو اختلافات الدفعات الكبيرة أو الحركية البطيئة. النهج الموصوف هنا قابل للتكرار ، وسهل التوسع ، ويسمح للمرء بالتحكم بدقة في توقيت وحالة تحويل الأميلويد.

<table><tbody><tr><td>2- (N-مورفولينو) حمض الإيثان سلفونيك (MES)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) ثيرمو</td> <td>/ بيرس</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>الحمض النووي من المنوية السلمون</td><td>سيجما</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>الحمض النووي الريبي من خميرة التورولا</td><td>سيجما</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازير</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة تريس</td><td>فيشر</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>المعدات:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>حمام مائي</td><td>فيشر ساينس</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer كاسيت غسيل الكلى</td><td>Thermo / Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

تقوم البروتينات بمهام حاسمة في الكائنات الحية من خلال ممارسة الوظائف المستمدة من طياتها ثلاثية الأبعاد المحددة. على الرغم من أن الهياكل الأصلية لعديد الببتيدات تحقق العديد من الأغراض ، إلا أنه من المسلم به الآن أن معظم البروتينات يمكن أن تتبنى مجموعة بديلة من الأميلويد الغني بطبقة بيتا. ترتبط ألياف الأميلويد غير القابلة للذوبان في البداية بأمراض بشرية متعددة ، ولكن يتم عرضها بشكل متزايد كلاعبين وظيفيين يشاركون في العديد من العمليات الخلوية المهمة. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الأميلويد المودع في أنسجة المريض على مكونات غير بروتينية ، مثل الأحماض النووية والجليكوزامينوجليكان (GAGs). يمكن أن تسهل هذه العوامل المساعدة تكوين الأميلويد ، مما يؤدي إلى توليد أنواع مختلفة من الرواسب غير القابلة للذوبان. من خلال الاستفادة من فهمنا لكيفية طي البروتينات بشكل خاطئ عبر مرحلة وسيطة من سلائف الأميلويد القابلة للذوبان ، ابتكرنا طريقة لتحويل البروتينات الأصلية إلى ألياف الأميلويد في المختبر. يسمح هذا النهج للمرء بتحضير الأميلويد بكميات كبيرة ، وفحص خصائص الأميلويد المتولد من بروتينات معينة ، وتقييم التغييرات الهيكلية المصاحبة للتحويل.

تعتمد القدرة على تحويل البروتينات الأصلية مباشرة إلى أميلويد على التغيير التشكلي الذي يحدث عند درجة حرارة عالية في محلول MES المنظم. ويعد الترسيب في المحلول مؤشراً جيداً على تجمع البروتينات واحتمالية تكوين الأميلويد. ومن ناحية أخرى، لتمكين استقرار قليلات القسيمات البروتينية الذائبة، يُستخدم EDC لربط البروتينات تشابكياً لتثبيت التشكيل قليلي القسيمات المستحث في محلول MES المنظم. ونتيجة لذلك، تكون قليلات القسيمات البروتينية المستقرة عبارة عن بروتينات متعددة الوحدات (الشكل 1)، والتي تختلف عن البروتينات الأصل...

يمكن للبروتينات إما أن تتبنى بنية أصلية أو تتحول إلى أميلويد غير قابل للذوبان. تؤدي الظروف التي تفضل مسار الطي الخاطئ إلى تكوين أنواع مختلفة من ألياف الأميلويد. تسمح الطرق الموضحة هنا بالتحويل السريع للبروتينات الأصلية إلى أميلويد في المختبر.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول بسرعة على الأميلويد fis من أي بروتين في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق إذابة البروتين المفضل في المخزن المؤقت MES للحث على طي الهيكل بشكل خاطئ. يمكن بعد ذلك تحضين البروتين عند درجة حرارة عالية ، مما يعزز تكوين الأميلويد في حالة عدم وجود عوامل مساعدة أخرى.بدلا من ذلك ، يتم ربط البروتين بواسطة EDC من أجل توليد أربطة بروتينية قابلة للذوبان مستقرة ، وهي مقدمة الأميلويد. أخيرا ، يتم خلط العوامل المساعدة غير البروتينية مع أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان المستقرة للسماح بتكوين نتائج الأميلويد الهجينة التي تظهر أن البروتينات الأصلية يمكن تحويلها بسهولة إلى تأكيد الأميلويد عند تسهيلها من خلال الظروف المواتية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض البروتين الخاطئة ، مثل مدى دقة أشكال الأميلويد من قلات البروتين القابلة للذوبان ، وما إذا كانت الأنواع المختلفة من الأميلويد لها وظائف بيولوجية ومرضية مميزة.للبدء ، قم بإعداد مخزن MES المؤقت كما هو موضح في بروتوكول النص لكل من البروتين النشواني فقط والبروتين القابل للذوبان المستقر. ثم تزن جميع الأربطة البروتين المفضل وتعيد تشكيله إلى 10 ملليغرام لكل مليلتر في المخزن المؤقت MES. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام ألبومين مصل الدم البشري أو HSA ، واحتضان المحلول عند 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة أربع ساعات.بحلول نهاية الفترة ، يظهر راسب أبيض في المحلول. قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ لكل حجم. T tris ، HCL غسيل البروتين في شريط غسيل الكلى بين عشية وضحاها لاستبداله إلى المخزن المؤقت المطلوب.لمزيد من التحليل ، قم بإعداد عينة تحكم من البروتين الأصلي باتباع هذه الخطوات دون هطول الأمطار الحرارية. لتحضير البروتين القابل للذوبان المستقر ، تزن جميع الأربطة البروتين المفضل وتعيد تكوينه إلى 10 ملليغرام لكل مليلتر. في مخزن MES المؤقت ، اترك محلول البروتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.قم بإعداد مخزون جديد من 20 ملليغرام لكل مليلتر EDC في المخزن المؤقت MES. امزج محاليل البروتين و EDC بنسبة اثنين إلى خمسة ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين بعد الحضانة. قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ لكل حجم من tris HCL ، وقم بغسيل البروتين في كاسيت غسيل الكلى طوال الليل لاستبداله بالمخزن المؤقت المطلوب.لمزيد من التحليل. قم بتخزين البروتين القابل للذوبان المستقر في جميع الأربطة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. سيتم استخدام هذا المعلق لتحضير الأميلويد الهجين لتحضير كل من الحمض النووي المحتوي على الأميلويد والحمض النووي الريبي المحتوي على الأميلويد.امزج الحمض النووي والبروتين القابل للذوبان المستقر كل الأربطة بنسبة واحد إلى واحد. اترك الخليط على أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل خلال هذه الفترة. يظهر الراسب غير القابل للذوبان في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 ملليغرام لكل مليلتر أو أعلى.لتحضير الهيبارين المحتوي على الأميلويد ، اخلطي الهيبارين والبروتين القابل للذوبان المستقر ، جميع الأربطة بنسبة واحد إلى واحد قبل احتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. على غرار الحمض النووي الذي يحتوي على الأميلويد في الراسب القابل للذوبان مرئي في المحلول. عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 ملليغرام لكل مليلتر أو أعلى ، فإن القدرة على تحويل البروتينات الأصلية مباشرة إلى الأميلويد تعتمد على التغيير التأكيدي الذي يحدث عند درجة حرارة عالية.في المخزن المؤقت MES ، يعد هطول الأمطار في المحلول مؤشرا جيدا على تراكم البروتين وتكوين الأميلويد المحتمل للسماح لقلة البروتين القابل للذوبان بالاستقرار. يستخدم EDC لربط البروتينات لترسيخ تأكيد قلة القلة المستحث في المخزن المؤقت MES. نتيجة لذلك ، فإن البروتين المستقر allgas عبارة عن بروتينات متعددة الأبعاد تختلف عن البروتين الأصلي الأحادي أو الركام المستحث بالحرارة.عند فصلها بواسطة بروتين قابل للذوبان مستقر في صفحة SDS ، يمكن لجميع الأربطة أن ترتبط بسهولة بالأحماض النووية ، بما في ذلك كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي بطريقة استقلالية التسلسل. لذلك ، يمكن إجراء مقايسة تحول الهلام لتصور التفاعل المباشر بين البروتين القابل للذوبان المستقر وجميع الأربطة والحمض النووي ، مما قد يؤدي إلى هجرة متأخرة للحمض النووي على هلام AROS. السمية الخلوية هي طابع نموذجي للبروتين القابل للذوبان.استقرت جميع الأربطة البروتين القابل للذوبان ، وجميع الأربطة التي تسببت في موت الخلايا التي يمكن اكتشافها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. كما هو موضح هنا ، فإن الخلايا RP I 8 2 2 6 معرضة للغاية للبروتين القابل للذوبان ، وهو جميع الموت الناجم عن الأربطة والذي يتم قياسه عن طريق تلطيخ يوديد البروبيديوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أنواع مختلفة من الأميلويد من أي بروتين من اختيارك في المختبر.

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توليد سريع للأميلويد من البروتينات الطبيعية In vitro

SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

المصدر: Balczon, R., et al. طرق الكشف عن الأميلويدات السامة للخلايا بعد إصابة الخلايا البطانية الرئوية بالزائفة الزنجارية. J. Vis. إكسب. (2018)يوضح هذا الفيديو إجراء توليد مادة طافية سامة للخلايا من الخلايا البطانية الرئوية بعد الإصابة بالزائفة الزنجارية. يوضح كيف تعطل البروتينات المستجيبة البكتيرية بنية الخلية المضيفة وتحفز إطلاق قليلة الأميلويد السامة للخلايا في المادة الطافية.

الحصول على الأميلويدات السامة للخلايا بعد العدوى البكتيرية للخلايا البطانية الرئوية للفئران

نحن تصف أساليب لدراسة جوانب amylopathies في...

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

تم وصف طريقة كروماتوغرافية من خطوتين لتنقية بروتين Shadoo المؤتلف المعبر عنه كأجسام إدراج في الإشريكية القولونية ، بالإضافة إلى بروتوكول لتحويل Shadoo المنقى الليفي إلى هياكل أميلويد.

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

يتم تقديم بروتوكول تعبير سهل الاستخدام وخالي من الخلايا لدمج نظائر الأحماض الأمينية غير الكنسية في البروتينات الخاصة بالبقايا ، بما في ذلك التحليل النهائي ، للدراسات الطبية والصيدلانية والهيكلية والوظيفية.

التأسيس-بقايا محددة من Noncanonical الأحماض الأمينية في البروتينات نموذج باستخدام<em&gt; كولاي</em&gt; نظام النسخ، ترجمة خالية من خلية

وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة "المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.

في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي

وترد أساليب بسيطة لما أبدته من إنتاج أميلويدس السامة للخلايا بعد إصابة بطانة الرئوية الزائفة الزّنجاريّة.

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

نقدم هنا بروتوكولا لتحليل نمو رشاشيه الخنزير وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات الذرة معربا عن البروتينات المضادة للفطور.  استخدام سلالة الإعراب عن التجارة والنقل (أ) الخنزير نحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. المقايسة سريعة وموثوق بها، واستنساخه.

تثبيط النمو رشاشيه الخنزير و "إنتاج الأفلاتوكسين" في "الإعراب عن الذرة المعدلة وراثيا" المانع α-الأميليز من purpureus لابلاب ل.

المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

هنا ، نصف نظام الخميرة الذي يعيد تكوين γ السكريتيز البشري. يسمح هذا النظام بتحديد ودراسة الطفرات التي تؤثر على النشاط وفحص مثبطات γ-secretase (GSIs). باستخدام فقدان الخصائص الوظيفية للطفرات العائلية لمرض الزهايمر ، من الممكن فحص معدلات γ-secretase (GSMs).

خميرة الخميرة نماذج مرض الزهايمر لفحص الجينات والطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على إنتاج بيتا الأميلويد بواسطة γ-سيكريتاز

اكتشف طريقة سريعة لتوليد ألياف الأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر باستخدام درجات حرارة مرتفعة وروابط EDC الكيميائية. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة آليات تكوّن الأميلويد.

التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر

استكشف المزيد من الفيديوهات