طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في وظيفة عامل النسخ NF kappa B في دماغ البالغين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تربية الفئران المعدلة وراثيا الأولى التي تمنع على وجه التحديد نشاط NF kappa B في الخلايا العصبية. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في اختبار العواقب السلوكية لتثبيط NF kappa B باستخدام النمط المكاني أو الفصل أو الحظائر أو المتاهة.

الخطوة الثالثة هي الوفرة الدقيقة للحيوانات ، وإزالة الأدمغة ، والتقسيم الصحيح لها. الخطوة الأخيرة هي تحليل التأثيرات النسيجية والهيكلية ، مثل تصور نتوءات الألياف الطحلبية عن طريق التلوين المناعي. في النهاية ، يمكن أن يربط استخدام اختبار السلوك متبوعا بعلم الأنسجة التغيرات في التعلم المعتمد على التلفيف المسنن بالتغيرات الهيكلية في الأنسجة المرتبطة بها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل مزهرية المريخ هي أن روابط فصل النمط المكاني توفر MA الفرصة لقياس عمليات التعلم المضادة للاعتماد على الطفل على وجه التحديد بالإضافة إلى التنكس العصبي والتجديد في منطقة الدماغ هذه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، مثل التعلم مثل فصل الأنماط الخاصة. سيتم عرض المتاهة بواسطة أنجيلا كولا ، فنية من مختبري.

سيتم تقديم التروية من قبل بيتر هايمان ، باحث مشارك. ثم سيتم عرض تقسيم الأدمغة بواسطة فني أولريش KA. وأخيرا ، سيتم تقديم الفحص المجهري للمسح الضوئي متحد البؤر من قبل جانين مواه ، طالبة الدكتوراه في مختبري تنفيذ فصل النمط المكاني.

بارنز ميز الاختبار السلوكي وفقا للإرشادات الدولية والمحلية. في هذا الاختبار ، من المهم استخدام ذكور الفئران فقط التي يبلغ عمرها ستة أشهر على الأقل. لكل سلسلة اختبار ، يجب أن تكون في غضون أربعة أيام من العمر ويجب على نفس المشغل إجراء جميع الاختبارات قبل الاختبار.

يجب إطعام الفئران نظاما غذائيا قياسيا بحيث يتم تحفيزها بالطعام الحلو. لإعداد الاختبار أولا ، احصل على صفيحة بيضاء قطرها 120 سم مصنوعة من البلاستيك الصلب. يمكن أن تكون إشارات المتاهة الإضافية مصنوعة من مواد مختلفة وقد يكون لها أشكال مختلفة.

الأهم من ذلك ، يجب أن يكون لديهم تباين عال حتى يتم التعرف عليهم بوضوح من قبل عجلات الجري الحيوانية. السلالم والأنفاق كلها إشارات جيدة. ضع اللوحة تحت العديد من مصابيح الفلورسنت النيون ذات الكثافة المعتدلة ، بحيث يتم تحفيز الفئران على الخروج من الضوء.

يجب التحكم في الرطوبة في الغرفة وعند 22 درجة مئوية ثابتة. الآن قم بإعداد نظام تتبع الفيديو. ضع الكاميرا على ارتفاع 115 سم فوق مركز اللوحة.

بعد ذلك ، قم بإرفاق إشارات متاهة إضافية متعددة الألوان بقطعة قماش بيضاء اللون تناسب اللوحة. ضعها بالقرب من منتصف القماش بحيث يمكن رؤيتها بسهولة للحيوانات. الآن ، قم بتنظيف اللوحة بعناية باستخدام المطهر السريع الذي يمكنه إزالة أي رائحة من الإعداد التجريبي.

ضع سبعة بيوت طعام صفراء متطابقة على الطبق الأبيض. يجب وضع علامة على مواقعهم بشكل لا لبس فيه قبل يوم واحد من بدء الاختبارات ، وتعويد كل فأرة على القرص. ضع مكافآت حبيبات الطعام الحلو مثل حلقة الفاكهة المقطعة إلى أرباع داخل كل من بيوت الطعام السبعة لتجربة السكن.

ضع كل فأرة على نقطة بداية اللوحة واتركها لمدة 10 دقائق للاستكشاف. سجل هذا الاستكشاف بين الفئران. نظف الطبق الدائري وبيوت الطعام بمطهر سريع.

قم أيضا بتجديد المكافآت الغذائية. في الأيام السبعة المتتالية التالية ، قم بإجراء تجارب الاختبار للاختبارات. يتم إغلاق جميع المنازل باستثناء منزل واحد بشريط شفاف للتجربة بأكملها.

إنه دائما نفس المنزل. لا يزال كل منزل محملا بمكافأة ويتم إجراء الاختبار مثل تجربة التعود. قم بإجراء الاختبارات في نفس الساعة من اليوم لكل لتجنب الاختلافات اليومية.

في وقت لاحق ، قم بتحليل زمن الوصول والمسافة المقطوعة والأخطاء باستخدام الإحصائيات المناسبة. يعرف البرنامج الأخطاء على أنها الاقتراب من بيت الطعام الخطأ أو الاتصال بالصندوق المناسب ، ولكن الفشل في الدخول إلى المكافأة واسترجاعها. لمقارنة المجموعات ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار bon fer post-hoc

بعد تخدير بحقن بين الصفاق من الفيرتين ، قم بنقفه بعناية بحرارة مع PBS الذي يحتوي على الهيبارين والبروبان. قم بعمل ثقب في البطين الأيسر باستخدام إبرة قياس 26. قم أيضا بعمل قطع في الأذين الأيمن للسماح للدم والتدفق الثمانية.

أدخل إبرة التروية في البطين الأيسر عند الفتحة بزاوية مستقيمة وعلى عمق من ملليمتر إلى ملليمترين. استخدم من 1.2 إلى 1.4 متر من الضغط الهيدروستاتيكي وقم بتحريك الماوس على مدى دقيقتين إلى أربع دقائق. اتبع الهيبارين والبروبان مع 4٪ بارالديهايد في PBS لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

يجب أن يكون معدل التروية 15 مل في الدقيقة. الآن قم بتشريح الدماغ. يجب أن يكون أبيض شاحبا مع عدم وجود أوعية دموية حمراء مرئية.

قم بإصلاح جميع الأدمغة المجمعة في 4٪ بارا فورمالديهايد عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي. يحمي Cryo الأدمغة في 30٪ من السكروز في PBS ، وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل بعد ذلك.

يتم تجميد الأدمغة على مرحلة نغمة التبريد وتقطيعها إلى أقسام أفقية بسمك 40 ميكرون. بعد تلطيخ الأقسام بجسم مضاد للخيوط العصبية M ، يمكن تصور إسقاطات الألياف الطحلبية باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر بالطول الموجي المناسب للجسم المضاد الفلورسنت. ابدأ المسح الضوئي بتكبير منخفض وتوجه إلى نتوءات الحصين والألياف الطحلبية.

ثم عند التكبير العالي ، قم بجمع عمليات مسح عالية الدقة للقسم C للألياف الطحلبية لتحليلها للتحقيق في التعبير عن I kappa B alpha AA الجين المعدل وراثيا. في أدمغة الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة ، تم عزل أدمغة الفئران ، وتقطيعها بالتبريد وتلطيخها باستخدام جسم مضاد ضد المسح بالليزر متحد البؤر GFP. كشف الفحص المجهري عن تعبير عال عن الجينات المعدلة وراثيا في منطقة CA الواحدة ، ومنطقة CA الثلاثة وفي DG لتحديد أقدم نوع خلية يعبر عن CAMK اثنين مدفوعا بألفا I kappa B alpha AA واحد في منطقة الحصين العصبية.

أقسام التبريد من فرس النهر كامبي من I Kappa BTTA. تم تلطيخ من أجل كورتين مزدوج وكشف التحليل متحد البؤر الجيني المعدل وراثيا عن إشارات GFP في الخلايا الحبيبية الإيجابية DCX الصغيرة المميزة بالأسهم التي تشير إلى تحريض التعبير عن الجين المعدل بواسطة CAMK اثنين من نشاط ألفا. تم تلطيخ الأقسام الإكليلية من الحصين من i kappa BTTA و i Kappa B ناقص الفئران للخيوط العصبية M لتصور إسقاطات الألياف الطحلبية والكشف عن التنظيم المعقد والحويصلي في I kappa BTTA الفئران.

تعرضت إسقاطات الألياف الطحلبية بشدة. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تثبيط NF kappa B إلى انخفاض كبير في سمك الشفرة المنوية وحجم DG أصغر لدراسة الأسباب المحتملة للعيب الهيكلي الدراماتيكي. تم تلطيخ شرائح الحصين الطازجة غير المثبتة من التحكم وأنا كابا BTTA الفئران باليشم الفلوري C ، مما يسمح بالكشف المحدد عن موت الخلايا العصبية.

لوحظ زيادة كبيرة في عدد العصبات المتدهورة في المعدلة وراثيا المزدوجة مقارنة بالضوابط المعدلة وراثيا الفردية. علاوة على ذلك ، تم الكشف عن زيادة كبيرة في السعة المشقوقة لثلاث خلايا موجبة في I kappa BTTA الفئران. على النقيض من ذلك ، كشف التلوين الكيميائي المناعي ضد DCX عن زيادة كبيرة في كميات الخلايا الإيجابية DCX في أدمغة فئران I kappa BT.

علاوة على ذلك ، لم يتم ترتيب الخلايا الإيجابية d CX في I kappa B TTA فرس النهر كامبي حصريا في المنطقة الحبيبية الفرعية ، ولكن تم العثور عليها أيضا في المناطق العميقة من dg. في حين أن الأسلاف الإيجابية ل D CX في التحكم كانت موضعية بشكل حصري تقريبا داخل المنطقة الحبيبية الفرعية. كان اختبار الكمية المتزايدة من الخلايا التي تعبر عن DCX نتيجة لنضج الأسلاف السابقة أو بسبب تكاثر الخلايا الإيجابية DCX.

تم حقن BRDU داخل الصفاق من i kappa BTTA والفئران الضابطة ، والتي تم تقسيمها بعد ذلك بالتبريد وتلطيخها ب DCX و BRDU لتحليل الانتشار. تم حقن BRDU مرة واحدة متبوعا بالتحليل بعد 24 ساعة. لتحليل التمايز ، تم إجراء ثلاث حقن يوميا ، تليها التحليل بعد سبعة أيام بعد حقن BRDU واحد.

لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية BRDU بين I kappa BTTA السلبية الضابطة. على النقيض من ذلك ، كشف نهج الحقن التسلسلي الثلاثة عن زيادة واضحة في كمية B-R-D-U-D-C-X الإيجابية في DG of I capa ، BTTA. قد يكون التمايز أو تكامل الخلايا الشفطرة DCX قد يكون قد زاد من أعداد الخلايا وربما تكون الخلايا من النوع الثالث قد شاركت في اختبار سلوك الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة على وجه التحديد.

في مهمة تعتمد على DG ، تم استخدام S-P-S-B-M. استكشفت التحكم I kappa B بيوت الطعام بشكل متسلسل في اليوم الأول من التجربة. بعد سبعة أيام من التدريب ، تمكنت من العثور على بيت الطعام المفتوح مباشرة.

في المقابل ، تستمر IA BTTA في استكشاف بيوت الطعام بشكل متسلسل حتى بعد التدريب. تشير ملاحظة الزيادات الكبيرة في المسافات المقطوعة وارتفاع زمن الانتقال ومعدلات الخطأ في I kappa BTTA مقارنة بحيوانات التحكم i Kappa B إلى أن هذه تعاني من عيوب تعلم شديدة. بمجرد إنشائها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة لكل إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد تطويرها.

قد تمهد هذه التقنية طريقها لعلماء الأعصاب الآخرين المهتمين بالمهام المعتمدة على الجيروسكوبات الدايد، مثل تكوين الخلايا العصبية للبالغين أو التنكس أو التجدد في الفئران.