باستخدام ماسحات ضوئية مسطحة لجمع عالية الدقة، ساقطا التوقيت صور من Gravitropic استجابة نبات الأرابيدوبسيس الجذر
يناير 25, 2014
يصف هذا البروتوكول عملية لجمع السريع للصور لشتلات نبات الأرابيدوبسيس الاستجابة لحافز الجاذبية باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة المتاحة تجاريا. يسمح أسلوب غير مكلفة، والقبض على ارتفاع حجم الصور عالية الدقة قابلة للتحليل الخوارزميات المصب.
الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح طريقة قائمة على الماسح الضوئي لالتقاط صورة عالية الدقة للاستجابة الاستوائية الجذرية في عملية النبات النموذجية. لبدء هذا البروتوكول ، تزرع البذور من مخزون البذور المعين على أطباق بتري التي تحتوي على وسط شفاف بعد أن تنبت البذور للفترة الزمنية المحددة ، تتم إزالة أطباق بتري من غرفة النمو ، وإعدادها للمسح الضوئي ، ثم توضع في ماسحات ضوئية مسطحة موجهة عموديا. ثم يتم قلب اللوحات بزاوية 90 درجة ومسحها ضوئيا لفترة زمنية محددة.
يتم حفظ الصور إما على الكمبيوتر أو جهاز تخزين البيانات واستخدامها لاحقا لمعالجة الصور. قبل الحصول على الصورة ، قم بإعداد لوحات aga تحتوي على نسيجتين نباتيتين ممسوحة ضوئيا ب. أولا ، امتصاص أي تكاثف مجمعة على غطاء وجوانب لوحة AGA بمنديل كيم.
بعد ذلك ، ضع كمية وفيرة من Triton X 100 لمنع التكثيف في المستقبل. أخيرا ، قم بإنهاء هذه العملية عن طريق لف اللوحة بشريط دقيق المسام لتأمين الغطاء والسماح للتهوية بالبدء في الحصول على الصورة. قم بإعداد مجلدات لحفظ الصور في الموقع المطلوب.
يتكون كل اسم مجلد من مجموعة من بيانات التعريف التي تتعلق بالمعلومات المراد مسحها ضوئيا. في هذا المثال، تم تضمين بيانات عمر المعرف الفريد وحجمه ومخزونه الأولي في أسماء المجلدات. يمكن بعد ذلك نسخ بيانات التعريف هذه ولصقها في اسم مجلد.
يفترض هذا البروتوكول أنه يتم استخدام أكثر من ماسح ضوئي واحد لجمع الصور ويوفر إرشادات لتوصيل ماسحات ضوئية متعددة بجهاز كمبيوتر واحد. لهذا السبب ، تم إعداد ثلاثة مجلدات لحفظ الصور. الخطوة التالية هي ضبط المؤقتات لوقت تجميع محدد.
نظرا لأنه لا يزال هناك قدر كبير من التحضير للقيام به في هذه المرحلة ، تأكد من ضبط المؤقتات لبعض الوقت الإضافي. بعد ذلك ، قم بتشغيل الماسح الضوئي الأول وافتح برنامج فحص العرض. ضمن علامة تبويب الإدخال، قم بتعيين المصدر إلى الماسح الضوئي الصحيح ومربع القائمة المنسدلة للتكرار التلقائي إلى لا شيء ضمن علامة تبويب الاقتصاص.
قم بتعيين منطقة المعاينة إلى الحد الأقصى واضغط على المعاينة. اختر مربع اقتصاص يلتقط منطقة الاهتمام وقم بتعيين منطقة المعاينة إلى مربع الاقتصاص. ثم قم بمعاينة الصورة مرة أخرى.
لحفظ البيانات التي تم جمعها في الموقع المطلوب ، اضغط على علامة تبويب الإخراج وابحث عن أسماء المجلدات التي تم إنشاؤها مسبقا والتي تتوافق مع كل ماسح ضوئي. قم بتشغيل الماسح الضوئي التالي وكرر فحص العرض. قم بإعداد الاتجاهات للماسحين الضوئيين الآخرين ، مع التأكد من اختيار المجلدات الصحيحة لحفظ البيانات فيها.
من المهم أيضا مراجعة كل علامة تبويب والتأكد من أن جميع إعدادات الماسح الضوئي كما تريد. وجد مختبرنا أن الإعدادات التالية تعمل بشكل أفضل لنوع جمع الصور التي يتم إجراؤها. ومع ذلك، قد تتطلب أنواع مختلفة من مجموعة الصور إعدادات أخرى.
بعد التحقق من جميع الإعدادات، اختر علامة تبويب الإدخال واضبط مربع القائمة المنسدلة للتكرار التلقائي على مستمر في جميع الماسحات الضوئية الثلاثة. ضع الألواح المحضرة في الماسحات الضوئية مع توجيه الشتلات أفقيا ووضع الجانب المحسود من الخلفية مؤقتا على الألواح لضمان الاستقرار في الماسح الضوئي. إذا كان تنفيذ هذا البروتوكول مع شريك ، فقم بتشغيل شخص واحد للألواح 90 درجة وعلى الفور شعرت بالخلفية ، فإن الشخص الآخر يضغط بعد ذلك على زر المسح ويقوم كلاهما بتأمين الخلفية إلى الماسح الضوئي باستخدام سلك بنجي.
يكرر هذه العملية للماسحات الضوئية الثانية والثالثة. يجب أن تستغرق كل صورة حوالي دقيقتين إلى ثلاث دقائق لمسح ضوئي بالكامل ستظهر الصور النهائية كما هو موضح. من الجيد التحقق من المجلدات التي يتم حفظ الصور فيها للتأكد من حفظها بشكل صحيح.
من المثالي إبقاء الماسحات الضوئية في منطقة خالية من الاضطرابات لمسح الوقت المحدد. ومن الحكمة أيضا مراعاة الظروف البيئية في منطقة المسح لضمان استجابات نمطية مثالية. الصور التالية هي أمثلة على تلك التي تم جمعها باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو.
اللوحات A و B و C و D هي الصور الأولى والأخيرة من فترة مسح واحدة. يظهر A وB المنطقة الممسوحة ضوئيا بالكامل. في حين أن C و D عبارة عن منطقة مقصوصة في المنطقة الممسوحة ضوئيا تظهر لوحة واحدة ، يمكن ملاحظة العديد من التناقضات.
يوضح الشكل أ التباين في الإنبات ومسار النمو. توضح الصورة B أن الصفائح يمكن أن تتراكم التكثيف بينما تعتبر الصورتان C و D نتائج جيدة بسبب النمو القوي للشتلات وجودة الصورة طوال الجري. يتناسب الإجراء الموضح في هذه الورقة مع مكانته الخاصة في عالم تصوير الجذر من حيث أنه عالي الإنتاجية ودقة عالية بينما لا يزال ميسور التكلفة نسبيا.
تتمثل إحدى المزايا الإضافية لهذا النهج في أنه يمكن تخصيصه بسهولة لتلبية احتياجات التصوير لمجموعة بحثية معينة. يتم تخصيص الطريقة أيضا لتصوير الآخرين.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لالتقاط صور عالية الدقة لبادرات Arabidopsis استجابةً للجاذبية باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة. وتتميز هذه الطريقة بفعالية التكلفة وتسمح بجمع كميات كبيرة من الصور المناسبة للتحليلات اللاحقة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا النبات
- تحليل الصور
- الاستجابة الموجهة للجذور
خلفية علمية
- تُستخدم نباتات Arabidopsis ككائن نموذجي في أبحاث النباتات.
- يعد فهم استجابات الجذور للجاذبية أمراً بالغ الأهمية لدراسات نمو النبات.
- تعمل تقنيات التصوير عالية الدقة على تحسين جمع البيانات للتحليل المظهري.
- توفر الماسحات الضوئية المسطحة حلاً منخفض التكلفة للتصوير عالي الإنتاجية.
الغرض من الدراسة
- لتوضيح طريقة تعتمد على الماسح الضوئي لالتقاط الاستجابات الموجهة للجذور.
- لتسهيل جمع الصور من أجل التحليل اللاحق.
- لتوفير بروتوكول تصوير قابل للتخصيص للمجموعات البحثية.
الطرق المستخدمة
- يتم إنبات البذور على أوساط شفافة في أطباق بتري.
- تُمسح الأطباق ضوئياً باستخدام ماسحات مسطحة ذات توجيه عمودي.
- يمكن توصيل عدة ماسحات ضوئية بجهاز كمبيوتر واحد لرفع الكفاءة.
- يتم ضبط إعدادات التقاط الصور للحصول على أفضل النتائج.
النتائج الرئيسية
- تظهر الصور الملتقطة تباينات في مسارات الإنبات والنمو.
- لوحظت مشكلات تكثف على الأطباق، مما أثر على جودة الصور.
- تم الحصول على صور عالية الجودة، تظهر نمواً قوياً للبادرات.
- تتيح هذه الطريقة تصويراً عالي الإنتاجية وقابلاً للتخصيص.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول وسيلة فعالة لتصوير استجابات الجذور.
- يمكن تكييف هذا البروتوكول ليلبي مختلف احتياجات التصوير ضمن السياقات البحثية.
- يوازن هذا النهج بين التكلفة والكفاءة في عملية جمع البيانات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يسمح التصوير المظهري عالي الدقة للاستجابة الانتحائية الجاذبية للجذور بتقليل المخاطر الميكانيكية في المراحل المبكرة من التحقق من الأهداف في عملية اكتشاف العلاجات القائمة على النباتات. يدعم نهج التصوير منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية هذا الثقة التنبؤية في دراسات وظائف الجينات من خلال توليد بيانات كمية بنظام التصوير الزمني المتقطع، وهي بيانات مناسبة لسلاسل تحليل الصور اللاحقة. وتعالج هذه الطريقة تحديات القابلية للتوسع في بيولوجيا الاكتشاف مع الحفاظ على سلامة البيانات لضمان الاستمرارية الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال القياس الكمي لمسارات نمو الجذور كقراءة مظهرية لوظيفة الجين.
- القيمة التشغيلية: يوفر تقليل المخاطر البيولوجية عبر الالتقاط عالي الإنتاجية لـ 216 استجابة فردية يومياً بدقة 4,800 dpi.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز المحفظة الدوائية عن طريق توليد بيانات صور عالية الجودة لتطبيقات تحليل الصور التي توضح التباينات في مسار النمو.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة بيولوجية مُثبتة (بادرات Arabidopsis على أوساط شفافة) لتدفقات عمل موحدة وقابلة للتكرار في عمليات فحص المركبات أو الفحص الجيني.
- القيمة التشغيلية: معالجة جاهزية المقايسة من خلال الحصول الآلي على صور بفاصل زمني كل بضع دقائق باستخدام ماسحات ضوئية مسطحة منخفضة التكلفة.
- قيمة القابلية للتوسع: تمكين إعادة استخدام المنصة والتكيف مع مجموعات بحثية مختلفة بفضل تصميم البروتوكول القابل للتخصيص وإمكانية توصيل ماسحات ضوئية متعددة بجهاز كمبيوتر واحد.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: يحافظ على استمرارية النظام ذي الصلة بالمرض من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحديد الكمي المظهري للاستجابة الانتحائية للجذور، وهي آلية محفوظة في الكائنات النموذجية.
- تخفيف المخاطر الميكانيكية: يقلل من الغموض في التحقق من الهدف من خلال عزل المتغير المستقل (إزاحة ناقل الجاذبية) وقياس المتغير التابع (النمو التصحيحي) بدقة زمنية عالية.
- الثقة التنبؤية: يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير مخرجات كمية تتيح التحليل الإحصائي لاختلافات الإنبات ومسار النمو.
تكامل مسار العمل والتدفق التشغيلي
تدمج هذه الطريقة في سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، وذلك من خلال تقديم بيانات نمط ظاهرية كمية وموحدة تساهم في اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف في المراحل المبكرة من التحقق من الهدف.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين ملاحظة النمو التصحيحي في جذور الشتلات المزاحة عن محاذاة متجه الجاذبية.
- الفحص: توفر توحيداً للمقايسات وقابلية للتكرار من خلال التحضير المنضبط للأطباق (منع التكثيف باستخدام Triton X-100 والشريط المسامي الدقيق) وبروتوكولات ثابتة لحفظ الصور.
- التحليلات: تولد مجموعات بيانات من الصور بنظام الفاصل الزمني بدقة 4,800 dpi، وهي مناسبة للقياسات الكمية لمسارات النمو واتساق الإنبات.
- الأبحاث الترجمية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال توفير قراءات نمطية ذات صلة بالمرض في نظام نموذجي قابل للاضطراب الجيني والدوائي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام بدلاً من كونها تقنية ذات استخدام واحد، وذلك نظراً لتكلفتها المنخفضة، وإنتاجيتها العالية، وسهولة تخصيصها عبر المجموعات البحثية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في توصيف نمط الاستجابة للانتحاء الأرضي.
- القيمة التشغيلية: تحقيق التقييس، وقابلية التكرار، والقابلية للتوسع عبر بروتوكولات المسح الآلي وتسمية المجلدات القائمة على البيانات الوصفية لتنظيم البيانات.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المتابعة أو الإيقاف، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال تقليل مخاطر النمط الظاهري مبكرًا باستخدام التصوير عالي الحجم وعالي الدقة.
- تأثير المحفظة: تمكين قرارات ترتيب الأولويات والتقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال وفرة بيانات الصور عالية الجودة التي تدعم تطبيقات تحليل الصور.
اعتبارات التنفيذ
- الخبرة العلمية المطلوبة في بيولوجيا النبات وبروتوكولات الحصول على الصور لتصوير جذور Arabidopsis.
- تتضمن احتياجات الأجهزة الماسحات الضوئية المسطحة ذات التوجه الرأسي والقادرة على توفير دقة 4,800 dpi، والربط بجهاز كمبيوتر واحد لتشغيل ماسحات ضوئية متعددة.
- يتطلب التوحيد القياسي بين الفرق تحضيراً متسقاً للأطباق (التحكم في التكثيف باستخدام Triton X-100 والشريط المسامي) وتسمية المجلدات بناءً على البيانات الوصفية لضمان حفظ البيانات بشكل قابل للتكرار.
- تتضمن اعتبارات التكيف عبر أنظمة النماذج المختلفة تعديل توجيه الماسح الضوئي وتحضير الأطباق بما يتناسب مع أحجام الشتلات وظروف النمو المختلفة.
- تشمل القيود العملية إدارة التكثيف على الأطباق وضمان استقرار توجيه الشتلات أثناء التدوير بزاوية 90 درجة لتحفيز الاستجابة للانتحاء الجذبي.
