تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد مزارع الخلايا الجذعية العصبية من مناطق مختلفة من دماغ القوارض البالغة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الأنسجة من منطقة ذات أهمية لفحص وجود الخلايا الجذعية العصبية وإمكاناتها. كخطوة ثانية ، قم بمعالجة الأنسجة في معلق خلوي للطلاء كثقافة أحادية الطبقة.

بعد ذلك ، استخدم ظروف الثقافة المحددة لنشر الخلايا الجذعية العصبية بشكل انتقائي ، والتحقق من صحة إمكانات التجديد الذاتي الخاصة بها. يتم الحصول على نتائج في المختبر تظهر أن الخلايا الجذعية العصبية متعددة القوة بناء على إمكاناتها التمايزية ، وكيف يمكن للعوامل المختلفة أن تؤثر على تجديدها الذاتي ومصيرها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأعصاب والطب التجديدي ، مثل مكان وجود الخلايا الجذعية العصبية الذاتية وكيفية التلاعب بها.

فكرنا في هذه التقنية لأول مرة عندما اكتشفنا مسارات تقليل الإشارات. سمح لنا ذلك بتحديد الخلايا الجذعية العصبية الذاتية المفترضة وكذلك تنظيم عددها. لذلك طبقنا هذه المعرفة لإنشاء ثقافات قوية لهذه الخلايا من مناطق مختلفة من الدماغ.

ادرس خصائصها واطرح السؤال ، هل هي بالفعل خلايا جذعية؟ يعد التحضير المناسب لطبق الثقافة أمرا بالغ الأهمية قبل يومين من التشريح المجدول ، وقم بتغطية الأطباق ببولي إل أورنيثين بمعدل 75 ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم احتضن الألواح طوال الليل في اليوم التالي ، واستنشق بولي إل أورنيثين وغسل كل منها جيدا مرتين بثلاثة ملليلتر من PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

يمكن بعد ذلك تخزين الألواح في حاضنة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع بعد إزالة الغسيل النهائي ، أضف الألياف نين المخففة من واحد إلى 250 في PBS عن طريق سحب العينة اللطيف. احرص على عدم الإفراط في تحريك الحل. ثم احتضان الألواح طوال الليل في يوم التشريح.

استنشق الفيبرونيكتين واغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS. أعد الألواح مع غسل PBS النهائي إلى الحاضنة وانتظر الأنسجة المنفصلة. يمكن تخزين الأطباق غير المستخدمة في الحاضنة لمدة تصل إلى أسبوع ، لكن لا تدعها تجف ولا تثيرها.

يتم توسيع نطاق عرض هذا البروتوكول إلى ثلاثة فئران بالغة. أولا ، تأكد من تبريد كتلة تقسيم الدماغ على الجليد قبل القتل الرحيم للفأر الأول. ثم قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر على الجليد مع خمسة ملليلتر من N اثنين من FGF متوسط وأساسي.

بعد إزالة الدماغ من فأر تم القتل الرحيم ، ضع الدماغ في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على PBS المثلج. ثم انقل الدماغ إلى طبق ثان من PBS دون أي شعر أو دم متبقي. الآن ضع الدماغ في كتلة التقسيم المبردة وأدخل شفرة حلاقة نظيفة جديدة في الكتلة بالقرب من المنطقة ذات الاهتمام التي سيتم إنشاء الخلايا منها.

بعد ذلك ، أدخل شفرة حلاقة نظيفة ثانية. ثلاثة ملليمترات تدلل إلى شفرة الحلاقة الأولى. ارفع الشفرات بعناية من الكتلة مع أخذ قسم الاهتمام معهم.

بتعويم القسم من الشفرة عن طريق غمره في PBS. الآن احصد منطقة الاهتمام باستخدام ملقط رقم خمسة. في هذا المثال، يحتوي القسم على التفويض الأمامي. واثق.

اجمع القسم في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من N اثنين من الوسط مع FGF الأساسي. ثم قلل حجم المحلول إلى مليلتر إلى ملليلتر. بعد ذلك ، في غطاء مزرعة الخلية ، اغمر طرف ماصة سعة مليلتر واحد في الجزء السفلي من المخروطي واستخدم حوالي 20 تدفقا من المحلول لفصل الأنسجة ميكانيكيا.

أوقف التركيب عندما يصبح المحلول متجانسا واتركه يجلس لبضع دقائق حتى تستقر الأنسجة الكبيرة غير المرتبطة في القاع. الآن انقل المادة الطافية المتجانسة دون أي قطع نسيجية إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 8.5 مل من الوسائط المكملة واثنين من الوسائط. امزج محتويات الأنبوب وجهز ستة محضرة.

لوحة حسنا. قم بإزالة PBS من الآبار ثم أضف ثلاثة ملليلتر من خليط الخلايا لكل بئر في ثلاثة آبار خلال الأيام ال 10 إلى 14 القادمة من الزراعة. استبدل الوسيط ب N اثنين من الطازجة كل يومين ، بدءا من 24 ساعة بعد الطلاء كل يومين ، أضف حجما جديدا من المكملات الغذائية في N اثنين.

متوسط إلى متوسط بالفعل على الخلايا. يعد الاجتهاد في ظروف وسائل الإعلام أمرا ضروريا للحفاظ على الخلايا غير متمايزة والسماح بتوسعها. بعد التغيير المتوسط الأول ، بقيت كمية كبيرة من الحطام الخلوي جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية.

ومع ذلك ، خلال الأيام القليلة التالية ، أصبحت مستعمرات الخلايا الجذعية المتميزة المتكاثرة مرئية. كان هناك أيضا مغزل أكثر استطالة مثل مجموعات الخلايا. هذه ليست خلايا جذعية عصبية وتم تجاوزها في النهاية مع انتشار الخلايا الجذعية العصبية.

على مدار الأسبوعين التاليين ، نمت الخلايا الجذعية العصبية بكثافة أكبر حتى وصلت إلى التقاء. كانت هذه الثقافات ملطخة إيجابية لعدد من علامات الخلايا الجذعية ، بما في ذلك SOX two و hesi و nest. وبالتالي توفير الثقة في أن مجموعات الخلايا التي تم اختيارها وتوسيعها هي بالفعل خلايا جذعية عصبية.

جاء مزيد من التأكيد بعد سحب FGF من الوسط ، مما سمح للخلايا بالتمايز لمدة 10 أيام إلى الخلايا العصبية والخلايا النجمية وجميع خلايا سيندرا. للحث على التمايز. استبدل الوسط N المكمل ب N اثنين مكملا ، متوسط وزرع الخلايا بهذه الطريقة لمدة 10 أيام ، واستبدال N اثنين كل 48 ساعة بعد 10 أيام ، استنشق الوسط وإصلاح الخلايا بملليلتر من 4٪ بارا فورمالديهايد لكل بئر لمدة 20 دقيقة.

اغسل المثبت بثلاثة ملليلتر من PBS مرتين لمدة خمس دقائق لكل غسلة. بعد شفط الغسيل الثاني ، أضف ملليلترين من PBS يحتوي على مصل حمار عادي بنسبة 5٪ و 0.1٪ تريتون × 100 لتجعيد الخلايا وسدها بينما تحتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في PBS الذي يحتوي على 5٪ NDS.

في هذا المثال ، يتم تطبيق جسم مضاد واحد مضاد ل T UJ لتحديد الخلايا العصبية بينما يتم استخدام الأجسام المضادة ل GFAP و CPA لتصور الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن على التوالي. بعد 20 دقيقة ، قم بشفط محلول الحجب وأضف 1.5 مل من خليط الجسم المضاد الأساسي لكل منهما. حسنا احتضان الخلايا.

أضف درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة بعد 90 دقيقة ، واغسل الخلايا بحمامين من PBS ، متبوعا بتطبيق واحد من PBS يحتوي على 5٪ NDS باستخدام ثلاثة ملليلتر من المحلول وخمس دقائق من الحمامات. بعد إزالة الغسيل النهائي ، ضع 1.5 مل من الأجسام المضادة الثانوية في PBS التي تحتوي على 5٪ NDS على كل منها. حسنا ، ثم ضع الطبق في الظلام ، أضف درجة حرارة الغرفة وانتظر 40 دقيقة.

بعد 40 دقيقة ، استبدل الثانوية بملليلترين من صبغة DPI المعدة حديثا وانتظر ثلاث دقائق. بعد شفط محلول DPI ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ثم تكون الخلايا جاهزة للفحص المجهري باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل اللطخات الغربية للنظر في التغييرات في التعبير عن البروتين والفسفرة الناتجة عن العلاجات الدوائية أو على مدار تمايز الخلايا. بعد تطوير هذه التقنية ، مهدت الطريق بالفعل للباحثين في مجال علم الأعصاب لاختبار طرق جديدة نفذوها في البحث في عدة أنواع مختلفة ، بما في ذلك الفئران والجرذان وحتى الرئيسيات.