Functionalization بمساعدة الميكروويف بولي (جلايكول الإثيلين) وعلى الراتنج الببتيدات للاستخدام في سلسلة Polymerizations وتشكيل هيدروجيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إضفاء الطابع الوظيفي على البولي إيثيلين جلايكول والببتيدات مع مجموعات أكريليت الميثامفيتامين لبلمرة السلسلة اللاحقة وتخليق الهيدروجيل. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع أولا بين أنهيدريد الأكريليك الميثامفيتامين والسلائف الوظيفية للأمم المتحدة في قارورة تلألؤ. الخطوة الثانية هي استخدام طاقة الميكروويف لتشغيل الوتد أو الببتيد.

بعد ذلك ، يتم إذابة PEG DM في كلورو ميثان ، أو يتم شق الببتيد من الراتنج. وتتم إزالة جميع مجموعات حماية السلسلة الجانبية في كوكتيل حمضي. الخطوة الأخيرة هي ترسيب PEG DM أو الببتيد الوظيفي من الأكريلاميد في الأثير.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام وقت البروتون بالرنين المغناطيسي النووي أو مالدي لقياس الطيف الكتلي للطيران لإظهار الوظيفة الناجحة للوتد أو الماكرو الببتيد. مرحبا ، اسمي إيمي فان هوف. أنا طالب دكتوراه في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تفاعل PEG مع فلوريد الأكريليك الميثامفيتامين هي أن التفاعل أسرع بكثير وأكثر صداقة للبيئة. مرحبا ، اسمي براندون ويلسون. أنا طالب جامعي في الهندسة الكيميائية في جامعة روتشستر.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المواد الحيوية ، مثل كيفية إنتاج الهلاميات المائية باستخدام ثنائي ميثيل peg يمكن استخدامه للتحكم في توصيل الخلايا العلاجية في الجزيئات. مرحبا ، أنا دانييل بينوا ، أستاذ مساعد في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر. تتمثل الآثار المترتبة على هذه التقنية في تطوير علاجات لمجموعة متنوعة من الأمراض حيث يمكن استخدام المركبات المركبة لتطبيقات توصيل الخلايا والأدوية.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قام Pred بتجفيف الأواني الزجاجية المطلوبة في فرن لمدة ساعة واحدة لمنع التلوث بالماء في قارب مصل اللبن الكبير. الخروج من خمسة جرامات من الوتد بوزن جزيئي يتراوح بين 1000 و 100،000 دالتون. إذا كانت موجودة ، فقم بإزالة القطعة البلاستيكية من غطاء قارورة التلألؤ في الغطاء الكيميائي.

قم بتوزيع 10 مولار فائض من أنهيدريد الأكريليك الميثامفيتامين في قارورة تلألؤ ممزقة. ثم أضف PEG إلى القارورة. بعد ذلك ، قم بلف الغطاء على القارورة وضع القارورة في الميكروويف.

اضبط الميكروويف على خمس دقائق على أقصى طاقة مع ارتداء قفازات مقاومة للحرارة. أخرج القارورة من الميكروويف كل 30 ثانية. ثم شد الغطاء بالكامل ودوامة العينة لمدة 30 ثانية.

قم بفك الغطاء قبل إعادة القارورة إلى الميكروويف. كرر هذه الخطوات حتى يتم طهي المحلول في الميكروويف لمدة خمس دقائق كاملة. بعد إخراج القارورة من الميكروويف ، قم بفك الغطاء واترك PEG DM يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإذابة PEG DM في 10 إلى 15 مل من ثنائي كلورو ميثان. قم بترسيب PEG DM في 10 × فائض من الأثير المسبق لمدة 20 دقيقة. باستخدام قمع باكنر سبعة سنتيمترات وقارورة 500 مل.

اجمع PEG DM عن طريق الترشيح بالفراغ. بعد ذلك ، انقل PEG DM المصفى إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بإبرة قياس كبيرة مثقوبة عبر الغطاء للتهوية. ضع الأنبوب في غرفة مفرغة وجفف PEG DM طوال الليل.

بعد إزالة الأنبوب من غرفة التفريغ ، يذوب اللون الأحمر PEG DM في DI كلورو الميثان يترسب مع ثلج داثيل الأثير. لإزالة أنهيدريد الأكريليك غير التفاعلي بعد الترشيح والتجميع ، جفف PEG DM في غرفة مفرغة بنفس الطريقة كما كان من قبل. لتحليل الرنين المغناطيسي النووي للبروتون، ضع ما يقرب من 10 ملليغرام من PEG DM في قارورة تلألؤ وأضف ما يقرب من ملليلتر واحد من الكلوروفورم المنزع.

بمجرد إذابة العينة ، انقلها إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي النظيف. بعد ذلك ، اجمع أطياف البروتون بالرنين المغناطيسي النووي وقم بتشغيل العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 64 عملية مسح على الأقل للحصول على دقة بيانات كافية. بعد تصنيع الببتيد محل الاهتمام عن طريق تخليق الطور الصلب ، قم بتخزينه على الراتنج في DMF عند أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

ثم اجمع راتنج الببتيد عن طريق الترشيح باستخدام قمع بكر يبلغ طوله سبعة سنتيمترات مع ورق ترشيح وقارورة سعة 250 مل. قم بإزالة القطعة البلاستيكية من غطاء قارورة التلألؤ وانقل الراتنج إلى القارورة. باستخدام ماصة يمكن التخلص منها ، أضف ما يكفي من أنهيدريد الأكريليك الميثامفيتامين لتغطية الراتنج بعد لف الغطاء بشكل غير محكم على القارورة ، ضعه في الميكروويف واضبط المؤقت على ثلاث دقائق.

في أقصى طاقة عند ارتداء قفازات مقاومة للحرارة ، قم بإزالة القارورة من الميكروويف كل 15 إلى 20 ثانية. بعد شد الغطاء بالكامل ، قم بتدوير العينة لمدة 15 ثانية. قم بفك الغطاء قبل إعادة القارورة إلى الميكروويف.

كرر ذلك حتى يتم طهي المحلول في الميكروويف لمدة ثلاث دقائق كاملة. مع فك غطاء القارورة ، اترك محلول الببتيد يبرد إلى درجة حرارة الغرفة باستخدام كمية صغيرة من DMF وقمع باكنر بطول سبعة سنتيمترات. مع ورق ترشيح وقارورة 250 مل.

اجمع راتنج الببتيد من القارورة للانقسام والحماية العميقة. انقل راتنج الببتيد إلى قارورة تلألؤ جديدة ل 0.25 ملليمول من الأرجينين المحتوي على الببتيد. أضف 0.25 مل لكل من ثلاثي ISO ، والبروبيلين ، وثلاثة ستة ثاني أكسيد ، وثمانية أوكتان ، وثمانية أوكتان ، وثيول ماء منزوع الأيونات ، و 18.0 مل من TFA.

ثم قم بتدوير خليط التفاعل على دوار زلزال مختبري لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء ، قم بترسيب الببتيد بمقدار 10 × فائض من إيثيل الأثير قبل البرد. قسم المحلول بالتساوي بين أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر ، وقم بالطرد المركزي للعينات الأربع عند 3 ، 200 جم لمدة 10 دقائق لجمع الببتيد بعد الطرد المركزي ، وصب الأثير ، وإعادة تعليق الببتيد في 100 مل من إيثيل الأثير الطازج مقسمة بين أنبوبين مخروطية سعة 50 ملليلترا.

كرر عملية الطرد المركزي. يقوم Resus بتعليق الببتيد في 50 مل من الأثير الطازج مرتين ليصبح المجموع أربع غسلات إيثر بعد خطوة الطرد المركزي الأخيرة ، وصب نفايات الأثير وتجفيف الببتيد طوال الليل تحت الفراغ. لتحضير العينة لتحليل وقت الطيران في Maldi ، ضع ملليغراما إلى ملليغرامين من الببتيد في أنبوب einor سعة 1.5 مل وقم بإذابة العينة في مليلتر واحد من مذيب maldi.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مصفوفة 10 ملليغرام لكل مليلتر من Alpha Sano أربعة حمض سيراميك هيدروكسي في المذيب المتعدد. اجمع بين محاليل الببتيد والمصفوفة بنسبة واحد إلى واحد ، ضع ميكرولتر واحد من المحلول المركب في ثلاثة مواقع منفصلة على لوحة عينة MALDI. جفف البقع باستخدام مسدس حراري.

ثم أعد تحديد كل عينة وجففها. أخيرا ، اجمع بيانات وقت الرحلة MALDI وتأكد من زيادة 68 جراما لكل مول في الوزن الجزيئي بسبب إضافة مجموعة الأكريلاميد الميثامفيتامين إلى الطرف النهائي للببتيد. يظهر هنا طيف الرنين المغناطيسي النووي لثنائي كيلودالتون خطي PEG DM يعمل باستخدام طريقة الميكروويف بمساعدة هذا التفاعل.

يمكن استخدام تحليل الرنين المغناطيسي النووي للبروتون لحساب النسبة الوظيفية المئوية من النسبة الملحوظة إلى النظرية لبروتونات الميثاكريلات الطرفية إلى بروتونات PEG المركزية. النسبة المئوية الإجمالية للوظائف هي 91٪ ويتم تشغيل PEG DM بشكل كاف للاستخدام في تخليق الهيدروجيل. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل حول حساب النسبة المئوية للوظائف بسبب تعدد قمم البروتونات التي تنشأ في تحليل البروتون بالرنين المغناطيسي النووي لببتيدات البيب.

يتم التحقيق في وظائف الببتيد بسهولة أكبر باستخدام وقت مالدي لقياس الطيف الكتلي للطيران. يتضح هذا هنا حيث تم تصنيع الببتيد G-K-R-G-D-S-G وإخضاعه لوظائف الميثامفيتامين أكريلاميد ، تم شق جزء صغير من الببتيد لتقييم الوزن الجزيئي قبل الوظيفة ، والذي أظهر ذروة الوزن الجزيئي المرصودة عند 676 جراما لكل مول ، الوزن الجزيئي المتوقع للببتيد ، خضع باقي الببتيد لوظائف الأكريلاميد الميثامفيتامين قبل الانقسام بعد وظائف الميثامفيتامين أكريلاميد. تحدث ذروة الوزن الجزيئي المرصودة عند 744 جراما لكل مول ، وهو الوزن المتوقع للببتيد الوظيفي للأكريلاميد الميثامفي.

لإثبات وظائف كل من PEG DM والببتيدات الوظيفية من الأكريلاميد الميثامفيتامين ، تم إنتاج الهلاميات المائية PEG مع وبدون 0.5 مللي مولار. الأكريلاميد الوظيفي GK R-G-D-S-G الموضحة هنا هي تباين الطور التمثيلي وصور الفلورسنت الحية الميتة للخلايا الجذعية الجذعية على المواد الهلامية الوتد وحدها وعلى المواد الهلامية PEG التي تحتوي على الببتيد الوظيفي للميثامفيتامين. لم تكن الخلايا الجذعية الجذعية قادرة على الالتزام بالهلاميات المائية الوظيفية للأمم المتحدة ، ولكن عند إدراج ببتيد التصاق الخلية RGD ، كانت قادرة على الالتصاق بسطح الهيدروجيل والانتشار عليه.

تمثل الصور الميتة الحية جدوى سكان MSC المصنفين. بدلا من ذلك ، تهدف الصور الفلورية إلى ترسيم الحدود بين خلايا الالتصاق والاختلافات الصغيرة في طوبولوجيا الهيدروجيل ، والتي يمكن أن تكون صعبة تحت تباين الطور وحده. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا غير المنتشرة المزروعة على PEG فقط المواد الهلامية إيجابية لكل من الكالسيوم AM و AUM Homodimer مما يشير إلى أن الخلايا كانت تموت في وقت التصوير.

تتمثل إحدى المزايا العديدة للهلاميات المائية PEG في طبيعتها القابلة للضبط بدرجة كبيرة التي تعدل التركيب المحدد للوتد. يوفر الهيدروجيل للباحثين درجة عالية من التحكم في خصائص مثل معامل المرونة كما هو موضح هنا. من المعروف أن كل من الوزن الجزيئي PEG ونسبة الوزن يتحكمان في حجم شبكة الهيدروجيل ، والهيدروجيل الناتج ، والصلابة ، ومعدل إطلاق الأدوية المغلفة.

وقد تم إثبات ذلك من خلال إنتاج الهلاميات المائية ذات الوزن الجزيئي المتفاوتة PEG dm والتحقيق في معامل الهيدروجيل الناتج وحجم الشبكة كما يفترض زيادة الوزن الجزيئي للوتد. تسبب Macer في زيادة حجم شبكة الهيدروجيل وانخفاض صلابة الهيدروجيل ، ويمكن أيضا التحكم في حجم شبكة الهيدروجيل وصلابة الجل الناتجة عن طريق تغيير الوزن. تم إنتاج النسبة المئوية للهلاميات المائية PEG بوزن متفاوت.

تحديد النسبة المئوية للخطي 10 كيلودالتون PEG DM وصلابة الهيدروجيل وحجم الشبكة كما هو موضح هنا ، وتؤدي زيادة نسبة وزن PEG إلى انخفاض كبير في حجم الشبكة وزيادة صلابة الهيدروجيل. تم تشكيل الهلاميات المائية التي تحتوي على ألبومين مصل الأبقار المغلف باستخدام ربط الوزن الجزيئي المتغير كما هو موضح هنا. يحدث إطلاق ألبومين مصل الأبقار بسرعة أكبر من الهلاميات المائية التي تتكون باستخدام وزن جزيئي أعلى PEG DM نتيجة لحجم الشبكة الأكبر داخل الهيدروجيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع جائزة PEG DME باستخدام الطريقة بمساعدة الميكروويف وكيفية تقييم الوظيفية باستخدام البروتون بالرنين المغناطيسي النووي. بمجرد إتقان هذا الإجراء ، يمكن للمرء أيضا استخدام الفتح الحلقي للمجموعات القابلة للتحلل المائي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تأثير تحلل الهيدروجيل على وظيفة الخلية. يجب أن يكون لديك أيضا فهم جيد لكيفية استخدام هذه التقنية لدمج وظائف الأكريلاميد الميثامداداني بشكل انتقائي في تسلسلات الببتيد الطرفية النهائية وكيفية تقييم هذه الوظيفة باستخدام قياس الطيف الكتلي متعدد الأوقات للطيران.

شكرا للمشاهدة.