مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو رصد وتحليل تأثير التفاعلات بين الخلايا والمصفوفة على إعادة محاذاة الألياف وأنشطة إعادة تشكيل المصفوفة في نظام هلام الفبرين. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق بلمرة هلام فبرين ثلاثي الأبعاد يحتوي على حبيبات دقيقة على زجاج غطاء موضوع داخل مفاعل حيوي يتم التحكم في بيئته. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير معلق خلوي عالي التركيز يُستخدم لوضع تجمعات من الخلايا الليفية أو مستنبتات X في أنماط هندسية على سطح الهلام.

بعد ذلك، يتم تصوير العينة كل 15 دقيقة باستخدام مجهر تباين التداخل التفاضلي على مدار 48 ساعة. وتتمثل الخطوة النهائية في قياس مدى إعادة تنظيم الفبرين وإعادة تشكيله على شكل انفعال من مناطق مختلفة من الهلام باستخدام ارتباط الصور الرقمي. وفي النهاية، يتيح نظام المستنبت هذا ترتيب الخلايا في أنماط هندسية بسيطة، مما يسهل تصور واستقصاء الآليات الكامنة وراء إعادة تشكيل المصفوفة وإعادة محاذاة الألياف التي تحفزها الخلايا.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا الميكانيكية، مثل تأثيرات الإشارات الميكانيكية المكانية والزمانية الدقيقة على سلوك الخلايا والتغيرات الناتجة عن ذلك في المصفوفة النسيجية المحيطة. سيقوم Arabic de Jesus، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. قم بإذابة الفبرينوجين برفق في محلول ملحي تم تدفئته مسبقاً عند 37 °C طوال الليل لتحضير محلول مخزون بتركيز 33.3 mg/mL. قم بإعداد قالب على ورق شفاف لتحديد موقع كل قطعة مستأصلة (explant) وفقاً للهندسة الفراغية المطلوبة.

تكون كل نقطة متباعدة بنحو واحد إلى اثنين مليمتر. وتتوافق هذه المسافة مع التباعد المثالي لتوليد محاذاة الألياف بين النُّضرات. بعد ذلك، تُنظف جميع مكونات المفاعل الحيوي جيداً باستخدام 70%ethanol وتوضع المكونات المنظفة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات قبل البدء.

بعد تعقيم مكونات المفاعل الحيوي، قم بتثبيت القالب أسفل منطقة غطاء الزجاج بقطر 60 مليمتر حيث سيتم تحضير العينة باستخدام الشريط اللاصق. بعد ذلك، قم بتحضير معلق الخرزات الدقيقة، يليه الفيبرينوجين والثرومبين. ولتحضير المحاليل المخزنة، اخلط 0.017 مليلتر من المحلول المخزن للخرزات الدقيقة مع 0.149 مليلتر من DMEM في أنبوب طرد مركزي دقيق للوصول إلى تركيز 10 مليون خرزة لكل مليلتر.

بعد ذلك، قم بمعالجة المعلق بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لتشتيت الخرزات وتجنيس المحلول. أضف 0.22 milliliters من المحلول المخزون للفبرينوجين إلى 0.44 milliliters من منظم HEPES بتركيز 20 millimolar، و 0.1667 milliliters من محلول الخرزات الدقيقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter. اخلط المكونات برفق، ثم ضع الأنبوب على الثلج في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 15 milliliter.

تُخلط المكونات التالية معاً: 32.8 µL من الثرومبين المذاب في محلول ملحي بتركيز 25 units/mL، و 131 µL من منظم HEPES بتركيز 20 mM، و 2.46 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 2 M.

بعد ذلك، اخلط محاليل الثرومبين والفيبرينوجين المُحضرة بعناية عن طريق السحب والطرد بالماصة من خمس إلى 10 مرات حتى يتوزع المحلول بالتساوي. حاول تقليل إدخال الفقاعات إلى الخليط عن طريق عدم تفريغ الماصة بالكامل أثناء الخلط. انقل المحلول المختلط بواسطة الماصة إلى قوالب PDMS مربعة بمقاس ثمانية مليمترات على زجاج غطاء الشريحة في أسرع وقت ممكن، واترك الهلام ليتعدد في درجة حرارة الغرفة.

ستؤدي إضافة الثرومبين إلى تحول المحلول إلى هلام بسرعة في غضون 30 ثانية تقريباً بعد البلمرة، أغلق المفاعل الحيوي وجهز المستنبتات الخلوية؛ ابدأ بحصاد خلايا الأرومة الليفية الجلدية البشرية التي وصلت درجة تلاقيها إلى 70 إلى 90% من دورق T 75 باستخدام التربسين، ثم قم بطردها مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. انقل المفاعل الحيوي إلى كابينة السلامة الحيوية وأزل الغطاء بعناية مع اتباع الشروط التعقيمية. بعد ذلك، اشفط الوسط الغذائي وأعد تعليق الكتلة الخلوية للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 مليون خلية لكل Milliliter في وسط DMEM مع 10% FBS.

بعد ذلك، يتم إنشاء المستنبتات عن طريق تحميل الخلايا في ماصة دقيقة وحقن 0.3 µL من معلق الخلايا في هلام الفيبرين المبلمر. وبناءً على النمط الموجود في القالب، يجب أن يحتوي كل مستنبت على 6,000 خلية تقريبًا. وبمجرد وضع المستنبتات على الهلام، يتم إغلاق المفاعل الحيوي.

بعد ذلك، أدخل كتل التسخين وقم بتوصيل المزدوجات الحرارية بجهاز التحكم في درجة الحرارة. اضبط جهاز التحكم في درجة الحرارة على 37 °C واحضن الهلامات لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا بالاستقرار والالتصاق بمصفوفة الفبرين. ثم أضف حوالي 5 mL من وسط DMEM الذي تم تكييفه لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات مع 5% CO2 ومُدعم بـ 10% fetal bovine serum و 1% penicillin streptomycin و 0.1% amphotericin B و 10 µg/mL من aprotinin مباشرة في غرفة المفاعل الحيوي.

ثم أعد إغلاق المفاعل الحيوي. استخدم حقنة لإضافة خمسة ملليلترات إضافية من الوسط المكيف بثاني أكسيد الكربون عبر الوصلة المسننة في منفذ الإدخال لملء المفاعل الحيوي بالكامل، مع إزالة أي فقاعات تتشكل بعناية. قم بتجهيز مضخة حقن باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر أو 30 ملليلتر مملوءة بوسط إضافي مكيف بـ 5% carbon dioxide. صِل الحقنة مباشرة بمنفذ الإدخال الموجود في غطاء المفاعل الحيوي باستخدام أنابيب معقمة مزودة بوصلة lure lock.

اضبط معدل التروية في مضخة الحقنة على 0.01 milliliters per minute. ثم قم بتوصيل قطع معدلة من الأنابيب بكل من منافذ المخرج وضع النهايات في بيكر سعة 100 milliliter. ولجمع النفايات، استخدم رافعة مختبرية لضبط ارتفاعات تغذيات المدخل والمخرج بحيث لا يتكون فرق في الضغط في مصدر المفاعل الحيوي.

يتم تزويد المفاعل الحيوي بوسط غذائي طازج مكيف بنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال فترة التجربة. ومن أجل الحفاظ على قيمة pH وتوفير العناصر الغذائية وإزالة الفضلات، فإن محقنة سعة 10 milliliter مملوءة بالوسط الغذائي ستكفي لمدة 16 ساعة تقريبًا. ضع العدسة الشيئية 20 XDIC تحت نافذة الرؤية في المجهر وتأكد من أن المحلل المستقطب والمنشور جميعهم في مواضعهم الصحيحة.

بعد ذلك، افتح برنامج التصوير. قم بتركيز العدسة الشيئية على المنطقة الواقعة بين x explan الثلاثة، ثم احفظ إحداثيات X وY وZ لهذا الموقع في برنامج التصوير. ومن أجل تصوير المنطقة بأكملها بين x explan وحولها، اختر خيار التقاط صورة كبيرة وحدد حجم المنطقة.

سيسمح هذا بالتقاط صور متعددة حول المنطقة المحددة وإنشاء صورة مجمعة كبيرة، لذا يرجى ضبط شدة الضوء ووقت التعريض على أدنى قيم ممكنة. سيساعد ذلك في تجنب موت الخلايا الناجم عن السمية الضوئية مع الاستمرار في توفير دقة كافية للتمييز بين الخلايا، والخرزات الدقيقة، وألياف الفبرين. لاحظ أنه في هذه التجربة تحديداً، لا تكون ألياف الفبرين مرئية بسبب الكثافة العالية لخرزات تشتت الضوء في الهلام، لذا قم بتقليل كثافة الخرزات أو سمك الهلام من أجل ملاحظة ألياف الفبرين.

بعد ذلك، ابدأ بتتبع الانفعال. قم أولاً بإنشاء أو تنزيل كود MATLAB مخصص، ثم قم بتسجيل الصور باستخدام الخرزات الدقيقة (microbeads) الموزعة في جميع أنحاء الهلام كنقاط مرجعية. سيضمن تسجيل الصور أن تكون الصور التي يتم الحصول عليها ملتقطة من الموقع ذاته تماماً في كل مرة.

تمت ملاحظة إعادة محاذاة الألياف بين الشريحتين من خلال التقاط صور مجمعة (tiled images) كل 15 دقيقة. وعلى مدار فترة زمنية استغرقت 48 ساعة، تم استخلاص مناطق فردية من الصور المجمعة وتحليلها باستخدام خوارزمية تتبع الإجهاد. ومن أجل قياس الإجهادات الموضعية من خلال إزاحة الخرزات الدقيقة، توضح مخططات الكنتور توزيع أقصى إجهاد رئيسي في منطقة إعادة محاذاة الألياف المقابلة للرباط.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات تقريبًا إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل الوسم الفلوري للكولاجين وبروتينات الهيكل الخلوي، بالإضافة إلى قياس كمية هجرة الخلايا، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية مثل المسارات الميكانيكية الحيوية المشاركة في إعادة تشكيل الأنسجة، وكيفية تعديل هذه العمليات بواسطة المواد الكيميائية الحيوية المختلفة.