تحليل عيوب العضلات الهيكلية في يرقات أسماك الزرد عن طريق الانكسار الثنائي ومقايسات استجابة الهروب باللمس

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تقييم مدى تنظيم اللييفات العضلية في يرقات zebrafish الشفافة، وقياس مسافة سباحتها استجابةً للتحفيز اللمسي باستخدام كلتا الطريقتين. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تزاوج zebrafish، ثم جمع البيض القابل للحياة في الخطوة الثانية من المقايسة لتقييم البنية العضلية. يتم وضع جنين zebrafish مُخدّر ومُطلى مباشرة بين عدستين مستقطبتين على منصة مجهر ستيريو، بحيث يتم توجيه السمكة على طول المحور الجانبي لجسمها وتكون في وضع مسطح قدر الإمكان.

يتم بعد ذلك تصور الانكسار المزدوج وقياس سلامة العضلات كمياً. وفي الخطوة الثانية من مقايسة الهروب المستحث باللمس، توضع يرقة واحدة مغلفة في طبق بتري عميق، ثم يتم توسيطها في مجال رؤية المجهر الستيريو. يتم توجيه محفز حسي طفيف إلى اليرقة عن طريق لمس الذيل بدبوس حشرات، ويتم تصوير رد فعل الحيوان حتى يتوقف الجنين عن السباحة أو يسبح خارج مجال الرؤية.

وفي نهاية المطاف، يمكن قياس الاختلافات في تنظيم العضلات والاستجابات الحركية كمياً. وتكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنيات غير الباضعة في إمكانية تحليل عدد كبير من الأسماك بسرعة، ومراقبة عيوب العضلات الهيكلية في السمكة ذاتها في الجسم الحي (in vivo) على مدار عدة أيام. وتعد العروض المرئية لكيفية تركيب العدسات المستقطبة ووضع اليرقات في الاتجاه الصحيح أمراً حاسماً لضمان النجاح.

باستخدام هذه المقاييس، قم بإزالة البيوض غير القابلة للحياة من جميع المجموعات التي تم جمعها من الأسماك البالغة المتزاوجة. تظهر هذه البيوض عمومًا باللون الأبيض والمعتم بالعين المجردة، أو كمجموعة من الخلايا الداكنة غير المنظمة تحت المجهر، ثم أعد الأجنة إلى الحاضنة لمزيد من النمو بعد ثلاثة إلى سبعة أيام من الإخصاب. إذا ظل الجنين المستهدف داخل الغشاء الكوريوني، استخدم ملقطًا حادًا لإحداث تمزق بسيط برفق في غشاء الجنين المستهدف، ثم اقلبه رأسًا على عقب حتى يسقط الجنين للخارج.

قم بتخدير الأجنة المغلفة باستخدام trica للمساعدة في وضعها بشكل صحيح، ثم جهز مجهراً تشريحياً بعدسة مستقطبة يمكن تدويرها لضبط زاوية الضوء المستقطب. وبمجرد أن تستقيم الأجنة، ضع عدسة مستقطبة ثانية على منصة المجهر مباشرة أسفل العدسة العلوية، ثم ضع الأجنة مباشرة فوق العدسة الثانية. بعد ذلك، يجب وضع كل جنين مستهدف على طول المحور الجانبي لجسمه.

قم بتدوير العدسة العلوية مع إبقاء الجنين المطلوب في مجال الرؤية حتى يصبح محور الاستقطاب للعدستين متعامداً بزاوية 90 درجة، وتصبح الخلفية مظلمة تماماً. حرك الأسماك للتأكد من أنها مستلقية بشكل مسطح قدر الإمكان. إذا كانت السمكة منحنية، فإن القطع ذات التوجيه المسطح فقط هي التي ستسمح بمرور الضوء المستقطب وتظهر خاصية frt.

الآن، لاحظ نمط الانكسار المزدوج (birefringence) في الأسماك من النوع البري. تُظهر العضلات الهيكلية عالية التنظيم انكساراً مزدوجاً ساطعاً، حيث يكون معامل الانكسار للضوء الموازي للخيوط العضلية أعلى من الضوء المستقطب العمودي على هذه البنى. وعادةً ما تُظهر الأسماك التي تعاني من عدم تنظيم في العضلات الهيكلية، وهو ما يشير إلى اعتلال عضلي تنكسي عصبي أو خلل تنموي، انخفاضاً عاماً في الانكسار المزدوج.

سمة مميزة لمرض الحثل العضلي. غالباً ما تظهر نمطاً يشبه البقع من الانكسار المزدوج، حيث تمثل المناطق الداكنة تنكساً عضلياً وسط مناطق مضيئة من البنية العضلية الطبيعية. قم بجمع صور للأسماك تحت الضوء المستقطب لقياس الانكسار المزدوج كمياً.

احفظ الصور كملفات tiff. افتح صور الانكسار المزدوج (birefringence) في برنامج لمعالجة الصور. في حال استخدام Image J كما هو موضح هنا، ابدأ لكل صورة باستخدام أداة تحديد المضلعات (polygon selections tool) لرسم خط حول جسم السمكة لتحديد منطقة عضلة zebrafish المراد قياسها.

بعد ذلك، من القائمة المنسدلة للتحليل (analyze)، اختر "ضبط القياسات" (set measurements) لتحديد الإحصائيات المطلوبة للصورة. قم بتحديد المربعات الخاصة بـ "متوسط قيمة الرمادي للمساحة" (area mean gray value) و"أدنى وأقصى قيمة للرمادي" (min and max gray value) لإعداد مقايسة سلوك الهروب الناجم عن اللمس بعد يومين إلى سبعة أيام من الإخصاب. ضع الأسماك المطلية ذات الأهمية بشكل فردي في أطباق بتري عميقة، مع العمل على جنين واحد فقط في كل مرة.

قم بتوسيط السمكة في مجال الرؤية لمجهر ستيريو مجهز بنظام كاميرا رقمية، وابدأ التصوير المتسلسل بمعدل إطارات أكبر من أو يساوي 30 hertz. بعد ذلك، وباستخدام دبوس حشرات، المس ذيل الجنين لتقديم التحفيز الحسي، مع إيقاف التصوير عندما يتوقف الجنين عن السباحة أو يسبح خارج مجال الرؤية. وأخيرًا، قم بتحويل الصور المتسلسلة إلى ملف فيديو أو قم بتحليل الإطارات الفردية لصور الفاصل الزمني (time-lapse).

يمكن استخدام انكسار الضوء المزدوج غير المتصل (Offline birefringence) كاختبار فعال وغير جراحي لتسليط الضوء على حالة التنظيم الليفي العضلي في أجنة سمك الزيبرا الحية؛ حيث تظهر عضلات الهيكل العظمي في أسماك الزيبرا من النوع البري في اليوم الخامس بعد الإخصاب انكسارًا مزدوجًا عاليًا تحت الضوء المستقطب نظرًا لمصفوفتها المنظمة من الخيوط العضلية. وفي المقابل، تظهر الأجنة من نفس العمر والمصابة بطفرة متماثلة الزيجوت ممرضة في جين distro glycan أو DAG1 انكسارًا مزدوجًا متقطعًا يشير إلى وجود مناطق من التنكس العضلي. ويتوافق هذا النمط المتقطع والتطور السريع للتنكس العضلي خلال مراحل النمو المبكرة مع نماذج الأسماك الضمورية الأخرى.

يؤدي قياس الانكسار المزدوج في طفرات DAG one الضمورية بعد خمسة أيام من الإخصاب إلى تحديد انخفاض ملحوظ في السطوع ليصل إلى 27.9 ± 5.3% من الحد الأقصى للانكسار المزدوج المشاهد في أشقائها من النوع البري. ويعد هذا الانخفاض أكثر حدة من الانخفاض إلى 52.4 ± 5.5% الملاحظ في مورفينات mtm one الاعتلالية العضلية بعد ثلاثة أيام من الإخصاب. وبدلاً من ذلك، تميل نماذج الأسماك المصابة بالاعتلال العضلي إلى إظهار انخفاض عام في الانكسار المزدوج مقارنة بالنوع البري، حيث غالباً ما يكون هناك تضرر في تنظيم اللييفات العضلية في العضلات الهيكلية المحورية الرئيسية، ولكن دون وجود دليل على تغيرات تنكسية. ويمكن استخدام سلوكيات الهروب التي يتم تحفيزها باللمس لإثبات أن نماذج سمك الزيبرا المصابة بأمراض العضلات الهيكلية تظهر عيوباً حركية وصعوبات في السباحة.

يعرض هذا الفيديو الأول اختبار سلوك الهروب المستحث باللمس في أسماك الزيبرا من النوع البري. لاحظ كيف تسبح اليرقات الطبيعية بعيداً وبسرعة كبيرة بعد خمسة أيام من الإخصاب. وفي هذا الفيديو الثاني، تم رصد سلوك الهروب المستحث باللمس في اليرقات في اليوم الأول استجابةً للمس.

لاحظ كيف تظهر الأجنة الطافرة في اليوم الخامس بعد الإخصاب استجابة ضعيفة للمس وفشلاً في الخروج من مجال الرؤية بعد التحفيز. ثم تم تحليل مقاطع الفيديو إطاراً بإطار للتأكد من أن طفرات DAG one تظهر حركة ضعيفة مقارنة بمجموعات الضبط من النوع البري استجابةً للمنبهات اللمسية. وقد تم حساب متوسط المسافات التي استطاع كلا النوعين من الأجنة قطعها خلال فاصل زمني محدد، والتي تشير إلى تدهور في الوظيفة الحركية لدى طفرات DAG one.

بمجرد إتقان هذه التقنيات، يمكن تنفيذها على كميات كبيرة من الأسماك خلال فترة زمنية قصيرة، وهو أمر بالغ الأهمية عند إجراء عمليات فحص كيميائية أو فحوصات طفرات عالية الإنتاجية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق منهجيات أكثر توغلاً مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو المجهر الإلكتروني لاستقصاء العيوب في العضلات الهيكلية على المستويين الجزيئي والتركيبي.