تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه في المختبر صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ
October 26th, 2013
في المختبر يتم تطوير نماذج الصدمة إصابات الدماغ إلى إنتاج في الجسم الحي تشوه الدماغ. واستخدمت الإصابة تمتد الناجم عن الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الأبهر، والخلايا البطانية الدماغ. ومع ذلك، يستخدم نظامنا حاجز الدم في الدماغ (BBB) النموذج الذي يمتلك خصائص تشكل نموذجا المشروعة للBBB إلى إنشاء نموذج في المختبر TBI.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام إصابات التمدد كنموذج لإصابات الدماغ الرضحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الزراعة أولا ، وعكس الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة وآبار القيعان المرنة. الخطوة الثانية هي التفريق بين الخلايا عن طريق تقليل مصل ربلة الساق الجنينية في وسط الاستزراع.
بعد ذلك ، تصاب الخلايا باستخدام جهاز نقالة الخلية. الخطوة الأخيرة هي تقييم درجة الإصابة في الخلايا. في النهاية ، يتم استخدام الإصابة الناجمة عن التمدد في الخلايا البطانية الدماغية لإظهار الإصابة في الحاجز الدموي الدماغي في المختبر.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج إصابات الدماغ الرضحية لأنها تمثل التأثير الفعلي الذي يحدث أثناء إصابات الدماغ الرضية في الحاجز الدموي الدماغي باستخدام إصابات التمدد للخلايا البطانية الدماغية البحرية. ستظهر الإجراء الدكتورة إيلين سلفادور ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البحري في قارورة مزرعة T 75.
قم بتغيير الوسط مرتين في الأسبوع حتى الوصول إلى التقاء. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS. ثم قم بإزالة PBS و tryps.
قم بهانت الخلايا بملليلترين من محلول EDTA الدافئ. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى تتشتت طبقة الخلية. بعد ذلك ، عند ثمانية ملليلتر من وسط الثقافة في الخلايا ، اضغط على القارورة عدة مرات لفصل الخلايا.
اعرض الخلايا تحت المجهر لضمان الانفصال الكامل عن القارورة. ثم ماصة الوسط بخلايا منفصلة لأعلى ولأسفل. قم بتدوير القارورة لخلط معلق الخلية بعد ذلك.
أضف 20 ميكرولترا من تعليق الخلية في مقياس الخلوي الدموي ، واحسب عدد الخلايا. حدد كثافة الخلية وشاهد 20،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في البئر. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى الكولاجين.
واحد ستة مشفر مسبقا. قيعان مرنة بشكل جيد لوحات ثقافة بحجم إجمالي يبلغ ثلاثة ملليلتر لكل بئر. قم بتغيير وسط المزرعة مرتين في الأسبوع وقم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد حتى تلتقي.
لتمايز الخلايا ، قم بتغيير وسط ثقافة الخلايا بوسط التمايز ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في هذا الإجراء ، قم بتشغيل جهاز التحكم في إصابة الخلايا ، واضبط التأخير على 50 مللي ثانية. بعد ذلك ، اضبط ضغط المنظم على 15 رطل لكل بوصة مربعة واضغط على الزناد عدة مرات حتى يصبح ضغط الذروة المسجل مستقرا.
ثم اضبط ضغط المنظم على القيمة المطلوبة. بعد ذلك ، ضع لوحة الثقافة ذات القيعان الستة المرنة جيدا في حامل الدرج. تأكد من ضبط محدد البئر على حجم البئر الصحيح.
ثم ضع قابس المحول بإحكام فوق القابس ، وقم بإمساكه بإحكام في مكانه بيد واحدة مع دفع الزناد باليد الأخرى لتسجيل ذروة الضغط المتولد بعد ذلك. ضع اللوحة على الفور مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية للمدة الزمنية المطلوبة ، أو استخدمها على الفور للتجارب أو التقييم اللاحق لتقييم إصابة التمدد عن طريق مقايسة امتصاص DI. مباشرة بعد شد الخلايا عند 30 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل مليلتر من بقعة البقاء التي تعمل كعلامة سمية خلوية لوسط زراعة الخلية.
لتقييم إصابة التمدد عن طريق إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات. بعد التمدد ، تقوم الخلايا على الفور بإزالة 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا من ، حسنا ، افعل الشيء نفسه في كل نقطة زمنية بعد الإصابة ترغب في تضمينها في تحقيقك في إطلاق LDH. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لوسط زراعة الخلايا في أعلى إعداد لجهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق.
لإزالة أي بقايا خلية ، قم بإزالة المادة الطافية واستخدمها في الخطوات اللاحقة. بمجرد أخذ العينات اللازمة من نقاط زمنية مختلفة ، قم بتنظيف الخلايا باستخدام محلول التحلل المضمن في مجموعة فحص LDH. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط الفحص المضمن في مجموعة الفحص إلى كل بئر من لوحة بئر 96 المتوفرة في المجموعة.
ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخالي من الخلايا في بئرين متوازيين من 96. تحتضن لوحة البئر اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتقرأ الامتصاص عند 492 نانومتر. يظهر هنا فحص المجهر الضوئي للخلايا الطبيعية ضد الخلايا المصابة.
يتم تعبئة الطبقة الأحادية لخلية التقاء التقاء العادية غير الممتدة بإحكام واستطالة عندما يتم شد الخلايا عن طريق تطبيق نبضة ضغط ذروة من 1.8 إلى 2.0 رطل لكل بوصة مربعة ، فإنها تبدو أقل إحكاما. عندما تصاب الخلايا بشكل معتدل بنبض ضغط ذروة من 2.5 إلى 3.0 ، يبدو بعضها منتفخا ومشوهة. تتراجع الخلايا مع امتداد شديد من 3.5 إلى 4.5 رطل لكل بوصة مربعة.
فيما يلي الفحص المجهري الفلوري للطبيعي ضد الخلايا المصابة. عولجت الخلايا ببقعة قابلة للحياة بعد ساعتين من الإصابة. هذه هي الخلايا غير الممتدة للتحكم ، والخلايا الممتدة بشكل معتدل ، والخلايا شديدة التمدد.
يوضح هذا الشكل إطلاق إنزيم LDH في snat بعد إصابة التمدد LDH التي تم إطلاقها في المزرعة. تم قياس الوسط على فترات زمنية مختلفة بعد الإصابة الناجمة عن التمدد وتم التعبير عنه كنسبة مئوية من إجمالي L-D-H-L-D-H القابل للإطلاق الذي تم إطلاقه من الخلايا التي تعرضت للتمدد المنخفض والمتوسط. لم تختلف اختلافا كبيرا عن تلك الخاصة بعناصر التحكم غير الممتدة وعن بعضها البعض.
أطلقت الخلايا التي تعرضت للتمدد الشديد كمية أكبر بكثير من LDH مقارنة بجميع العينات الأخرى باستثناء العينة الممتدة بشكل معتدل في ساعة واحدة بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف إصابات الدماغ الرضحية في الخلايا البطانية للدماغ البحرية في المختبر.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة لنمذجة إصابة الدماغ الرضحية (TBI) في المختبر باستخدام إصابة التمدد على خلايا البطانة الدماغية. تؤكد الدراسة على أهمية نموذج حاجز الدم-الدماغ (BBB) لتكرار تأثيرات TBI بدقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث إصابة الدماغ الرضحية
الخلفية
- نماذج المختبر ضرورية لدراسة آليات TBI.
- إصابة التمدد هي تقنية مستخدمة لمحاكاة TBI.
- خلايا البطانة الدماغية حاسمة لفهم دور الحاجز الدم-الدماغ في TBI.
- النماذج الحالية تفتقر إلى الدقة في تكرار ظروف الجسم الحي.
غرض الدراسة
- لتطوير نموذج موثوق في المختبر لـ TBI باستخدام إصابة التمدد.
- لتقييم تأثير إصابة التمدد على خلايا البطانة الدماغية.
- لدراسة الآثار المترتبة على هذا النموذج للعلاج من TBI.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا البطانة الوعائية الدماغية البحرية المجهرية.
- تمايز الخلايا من خلال تقليل المصل.
- تطبيق إصابة التمدد باستخدام جهاز تمدد الخلايا.
- تقييم إصابة الخلية من خلال اختبارات الصلاحية وإطلاق LDH.
النتائج الرئيسية
- إصابة التمدد تؤدي إلى تغيرات قابلة للملاحظة في شكل الخلية.
- إطلاق LDH يرتبط بشدة إصابة التمدد.
- إصابات التمدد المعتدلة والشديدة تظهر اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية.
- يسمح هذا النموذج باستكشاف تأثيرات TBI على الحاجز الدم-الدماغ.
الاستنتاجات
- النموذج المطور يحاكي بشكل فعال TBI في المختبر.
- تساهم النتائج في فهم آليات TBI في الحاجز الدم-الدماغ.
- قد تساعد هذه التقنية في تطوير استراتيجيات علاجية لـ TBI.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This in vitro stretch injury model provides a scalable and reproducible system for studying traumatic brain injury mechanisms at the blood-brain barrier, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurotherapeutic discovery. By quantifying endothelial responses to controlled mechanical stress, the model supports predictive confidence in lead compound screening and pathway interrogation. Its simplicity and adaptability facilitate cross-functional collaboration and assay standardization across discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to blood-brain barrier disruption in traumatic brain injury.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled application of mechanical stretch injury.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by modeling physiologically relevant endothelial responses to TBI-relevant stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-dependent readouts via LDH release and viability assays for compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible injury levels across wells using regulated pressure pulses in flexible-bottomed plates.
- Scalability: Enables high-throughput evaluation of compounds targeting blood-brain barrier integrity under defined mechanical stress conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human-relevant blood-brain barrier pathophysiology using murine cEND cells that mimic in vivo barrier properties.
- Mechanistic De-risking: Clarifies dose-response relationships between stretch intensity and endothelial dysfunction, informing preclinical safety assessments.
- Predictive Confidence: Provides a disease-relevant system to evaluate candidate therapeutics for barrier protection or repair prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a mechanistically grounded platform to assess blood-brain barrier vulnerability in traumatic brain injury contexts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathways involved in endothelial response to mechanical injury, enabling target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized endothelial monolayers with quantifiable injury metrics for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative lactate dehydrogenase release and viability data to compare conditions and assess compound effects.
- Translational Research: Maintains biological relevance through use of brain microvascular endothelial cells that model blood-brain barrier function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for repeated evaluation of neuroprotective or barrier-stabilizing compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between traumatic brain injury and blood-brain barrier dysfunction.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized pressure application and defined injury assessment protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into blood-brain barrier-targeted compound effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on barrier integrity preservation under TBI-relevant stress.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and endothelial cell differentiation techniques.
- Dependent on access to a cell stretcher device capable of precise pressure control and uniform application.
- Necessitates standardization of injury parameters (pressure, duration) and assay timing across users and time points.
- Adaptation to other endothelial or co-culture systems may require validation of barrier properties and injury response.
- Practical limitations include variability in primary cell isolation and the need for optimization of stretch parameters per cell source and passage number.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Seeding of Endothelial Cells and Cell Differentiation
2:50
Stretch-induced Injury of Endothelial Cells
3:46
Assessment of Stretch Injury by Dye Uptake Assay and Lactate Dehydrogenase Release
5:20
Results: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier
6:50
Conclusion
