تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح استخدام إصابة التمدد كنموذج لإصابة الدماغ الرضحيّة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا البطانية للأوعية الدقيقة المرآتية في آبار ذات قيعان مرنة. وتتمثل الخطوة الثانية في تمايز الخلايا عن طريق تقليل مصل العجل الجنيني في وسط الاستزراع.

بعد ذلك، يتم إحداث إصابة في الخلايا باستخدام جهاز تمديد الخلايا. وتتمثل الخطوة النهائية في تقييم درجة الإصابة في الخلايا. وفي النهاية، تُستخدم الإصابة الناتجة عن التمدد في الخلايا البطانية الدماغية لإظهار الإصابة في الحاجز الدموي الدماغي في المختبر.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج إصابات الدماغ الرضية، لأنها تحاكي التأثير الفعلي الذي يحدث أثناء إصابة الدماغ الرضية في الحاجز الدموي الدماغي باستخدام إصابة التمدد للخلايا البطانية الدماغية البحرية. ستقوم الدكتورة Elaine Salvador، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بزراعة الخلايا البطانية للأوعية الدقيقة في الدماغ البحري في قارورة زراعة T 75.

قم بتغيير الوسط مرتين أسبوعياً حتى الوصول إلى حالة الالتحام. بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام PBS. ثم قم بإزالة PBS والتربسين.

قم بمعالجة الخلايا باستخدام 2 mL من محلول trypsin EDTA الدافئ. حضن الخلايا عند 37 °C لمدة خمس دقائق أو حتى يتشتت طبقة الخلايا. بعد ذلك، أضف 8 mL من وسط الزرع إلى الخلايا، ثم انقر على القارورة عدة مرات لفصل الخلايا.

افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من انفصالها التام عن الدورق. بعد ذلك، قم بسحب وسط الزرع الذي يحتوي على الخلايا المنفصلة بواسطة الماصة للأعلى والأسفل. ثم قم بتدوير الدورق لخلط معلق الخلايا.

أضف 20 µL من معلق الخلايا إلى مقياس دم (hemo cytometer)، ثم قم بعدد الخلايا. حدد كثافة الخلايا بحيث تكون 20,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في البئر. بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى الكولاجين.

قم بتعبئة أطباق زراعة ذات قاع مرن مكونة من ستة آبار مسبقة الترميز بحجم إجمالي قدره 3 mL لكل بئر. استبدل وسط الزراعة مرتين أسبوعياً وقم بتحضين الخلايا عند 37 °C لمدة أسبوع واحد حتى تصل إلى مرحلة الالتحام.

لإجراء تمايز الخلايا، استبدل وسط استزراع الخلايا بوسط التمايز، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في هذا الإجراء، قم بتشغيل جهاز التحكم في إصابة الخلايا، واضبط التأخير على 50 milliseconds. بعد ذلك، اضبط ضغط المنظم على 15 PSI واضغط على الزناد عدة مرات حتى يستقر ذروة الضغط المسجلة.

بعد ذلك، اضبط ضغط المنظم على القيمة المطلوبة. ثم ضع طبق استزراع الخلايا ذو القيعان المرنة المكون من ستة آبار في حامل الصينية. تأكد من ضبط محدد الآبار على حجم البئر الصحيح.

بعد ذلك، ضع قابس المهايئ بإحكام فوق البئر، وثبّت القابس بإحكام بيد واحدة بينما تضغط باليد الأخرى على الزناد، ثم سجّل ضغط الذروة المتولد بعد ذلك. أعد الطبق فوراً إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C للمدة المطلوبة، أو استخدمه فوراً في التجارب أو التقييمات اللاحقة لتقدير إصابة التمدد عن طريق مقايسة امتصاص DI. مباشرة بعد تمديد الخلايا، أضف 30 µL من صبغة الحيوية بتركيز 1 mg/mL، والتي تعمل كعلامة للسمية الخلوية، إلى وسط استزراع الخلايا.

لتقييم إصابة التمدد من خلال تحرر إنزيم lactate dehydrogenase. بعد التمديد، يتم سحب 200 µL من وسط زراعة الخلايا من البئر فوراً، وتكرر هذه العملية لكل نقطة زمنية بعد الإصابة يراد تضمينها في استقصاء تحرر LDH. بعد ذلك، يتم طرد وسط زراعة الخلايا مركزياً باستخدام أعلى إعداد لجهاز الطرد المركزي الدقيق لمدة خمس دقائق.

لإزالة أي حطام خلوي، قم بإزالة السائل الطافي واستخدمه في الخطوات اللاحقة. بمجرد أخذ العينات اللازمة من النقاط الزمنية المختلفة، قم بتحليل الخلايا باستخدام محلول التحليل (lysis solution) المرفق في طقم مقايسة LDH. بعد ذلك، أضف 100 µL من وسط المقايسة المرفق في طقم المقايسة إلى كل بئر من آبار طبق 96 بئر الموفر في الطقم.

بعد ذلك، أضف 100 µL من وسط استزراع الخلايا الخالي من الخلايا في بئرين متوازيين من طبق 96 بئر، ثم حضّن الطبق عند 37 °C لمدة 30 دقيقة واقرأ الامتصاصية عند 492 nm. يظهر هنا فحص المجهر الضوئي للخلايا السليمة مقابل الخلايا المصابة.

تكون الطبقة الأحادية من الخلايا الملتئمة وغير الممتدة في الحالة الطبيعية متراصة بإحكام ومستطيلة، بينما تبدو أقل تراصاً عند تمديد الخلايا بتطبيق نبضة ضغط قصوى تتراوح من 1.8 إلى 2.0 PSI. وعندما تتعرض الخلايا لإصابة متوسطة بنبضة ضغط قصوى تتراوح من 2.5 إلى 3.0، يظهر بعضها متورماً ومشوهًا. وتصبح الخلايا منكمشة عند التمدد الشديد الذي يتراوح من 3.5 إلى 4.5 PSI.

إليكم الفحص المجهري الفلوري للخلايا السليمة مقابل الخلايا المصابة. عولجت الخلايا بصبغة الحيوية بعد ساعتين من الإصابة. هذه هي الخلايا الضابطة غير الممددة، والخلايا الممددة بشكل متوسط، والخلايا الممددة بشدة.

يوضح هذا الشكل إطلاق إنزيم LDH في الوسط بعد إصابة التمدد؛ حيث تم قياس LDH الذي أُطلق في وسط الزرع عند فترات زمنية مختلفة بعد الإصابة الناجمة عن التمدد، وعُبر عنه كنسبة مئوية من إجمالي LDH القابل للإطلاق من الخلايا التي خضعت لتمدد منخفض ومتوسط. ولم يختلف ذلك بشكل ملحوظ عن الضوابط غير الممددة ولا فيما بينها.

أفرزت الخلايا التي تعرضت لتمدد شديد كمية أكبر بكثير من LDH مقارنة بجميع العينات الأخرى، باستثناء العينة التي تعرضت لتمدد متوسط بعد ساعة واحدة من تطوره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية لاستكشاف إصابات الدماغ الرضحي في الخلايا البطانية للدماغ البحري في المختبر.