الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة للخلايا العصبية المضادة D أو اثنين R أو N-M-D-A-R في عينات المرضى باستخدام مقايسة خلوية عالية الإنتاجية تعتمد على التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق التشبث الفرعي ، تسلسل CDNA الكامل للإنسان D اثنين R أو N-M-D-A-R داخل البلازميد. كخطوة ثانية ، يتم نقل خط الخلية البشرية ، مما يؤدي إلى التعبير عن سطح الخلية للمستضدات العصبية.

بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا المنقولة بمصل المريض وجسم مضاد ثانوي مناسب قبل اكتساب قياس التدفق الخلوي. من أجل الكشف عن ارتباط الأجسام المضادة بمستضدات سطح الخلية ، يتم الحصول على النتائج بناء على تحليل قياس التدفق الخلوي. هذا الاختبار القائم على خلية قياس التدفق الخلوي ثلاثي المنافذ العالي سريع وكمي وفعال لمجموعات كبيرة من عينات المرضى.

هذه ميزة كبيرة على استخدام الفحص القائم على الخلايا مع الكيمياء المناعية والتحليل متحد البؤر. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من فقدان الخلايا على مدار التجربة من أجل الحصول على العدد المناسب من الخلايا في مقياس التدفق الخلوي. احرص على عدم شفط الخلايا بين الغسيل.

حدد متجه تعبير مناسب للتعبير عن البروتينات عبر الغشاء ويتيح التعبير الخلوي المشترك للمستضدات والبروتين الفلوري الأخضر بشكل منفصل. على سبيل المثال ، يحتوي هذا المتجه على مراسل GFP محسن تحت سيطرة موقع دخول الريبوسوم الداخلي ، واستنساخ CD NA البشري كامل الطول في المتجه باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة بعد التحقق من المستنسخة عن طريق التسلسل ، وصنع مخزونات البلازميد المناسبة للاستخدام في ثقافة الشفافية. HEK 2 93 خلية في DMEM كامل مع مصل بقري الجنين 10٪.

حصاد الخلايا بواسطة التربسين بعد غسل واحد الطرد المركزي الخلايا وتعليق الخلية بيليه في dmm كاملة جديدة. عد الخلايا ، ثم قم بزرع مزارعين مليلتر في ستة ألواح آبار عند حوالي 70٪ من الطلاقة المشتركة ، وقم بتعيين آبار خلايا HEK 2 93 للتعداء مع تركيبات التعبير بالإضافة إلى ناقل التحكم. احتفظ ببعضها على خلايا HKE 2 93 المنقولة للتعويض لاحقا.

تحضير خلطات التعداء التي تتكون من 200 ميكرولتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم و 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي وأربعة ميكروغرام لكل مليلتر من البولي إيثارين. على الفور دوامة لمدة 10 ثوان واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل إضافة مزيج التعداء إلى كل بئر من ملليلتر كامل الطازج. قم بتغطية اللوحة ، ولف الجوانب بالبيرفيل والطرد المركزي عند 280 GS لمدة خمس دقائق للمساعدة في تعداء الخلية.

ثم قم بإزالة الفيلم الجزئي ثم ضع اللوحة في ظروف الاستزراع لمدة 18 ساعة. استبدل وسائط الاستزراع ب DM EM كامل جديد واحتفظ به في الثقافة لمدة 72 ساعة أخرى. لفصل الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من الفاريس إلى كل بئر واحتضن لمدة خمس دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية.

ثم أعد تعليق خلايا كل بئر في ملليلترين من 2٪ FBS في PBS ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي بعد ثلاث غسلات. أعد تعليق منصات الخلية عند 1 مليون خلية لكل مليلتر في محلول FBS 2٪. الآن صمم قالب 96 جيدا لاكتساب قياس التدفق الخلوي بحيث يتم التعامل مع خطوط الخلايا المختلفة مع كل عينة مريض أو جسم مضاد أولي.

ثم قم بزرع 50 ، 000 خلية لكل بئر في صفيحة بئر قاع V 96 ، قم بتكبيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 450 Gs لمدة خمس دقائق. قم بإمالة اللوحة بزاوية وقم بإزالة supra natin برفق مع الحرص على عدم شفط حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف التخفيف التسلسلي للجسم المضاد الأولي من أجل تقييم التعبير السطحي للمستضد.

ثم عينات المريض من أجل الكشف عن الأجسام المضادة ، احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام بعد ثلاث غسلات في 170 ميكرولتر من محلول FBS 2٪ ، أضف AF 6 47 المناسب الأجسام المضادة الثانوية المضادة للإنسان IgG للمريض ومكافحة الولايات المتحدة. IgG للأجسام المضادة الأولية. تهجين لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام بعد ثلاث غسلات.

يقوم Resus بتعليق الخلايا في 35 ميكرولتر من محلول FBS 2٪ لاكتساب خلية قياس التدفق الخلوي في مقياس التدفق الخلوي. قم أولا بإعداد جهاز أخذ العينات عالي الإنتاجية. احصل على 10,000 حدث لكل بئر وفقا لقالب اكتساب قياس التدفق الخلوي.

قم بتصدير البيانات ثم تحليلها باستخدام بوابة حزمة برنامج قياس التدفق الخلوي لخلايا HKE 2 93 الحية بناء على المبعثرات الداخلية الأمامية. أيضا بوابة على إيجابية GFP عالية لتحليل الخلايا المنقولة فقط. حدد متوسط شدة التألق لقناة AF 6 47 داخل الخلايا الموجبة ل GFP الحية.

ثم قم بتصدير البيانات إلى Excel أو المنشور للتحليل. ارسم تركيزات الأجسام المضادة الأولية مقابل MFI التي تم الحصول عليها من العينات المقابلة لكل مريض وعينة تحكم. حدد دلتا MFI احسب عتبة إيجابية الجسم المضاد عن طريق إضافة ثلاثة انحرافات معيارية فوق متوسط دلتا MFI لمجموعة التحكم.

ثم ارسم العينات الفردية المجمعة وفقا لمجموعة المرضى على رسم بياني. مثل العتبة كخط هنا. تم الحصول على الخلايا التي تعبر عن مستقبلات n methyl de aspartate أو مستقبلات الدوبامين الثانية في مقياس التدفق الخلوي باستخدام جهاز أخذ عينات عالي الإنتاجية.

أثناء التحليل ، تم تسيير الخلايا بناء على التشتت الأمامي للحجم وعلى التشتت الجانبي للحبيبات. عبرت خلايا TRANSFECTED HK 2 9 3 عن جزيء مراسل GFP في السيتوبلازم وتم استبعاد الخلايا المنقولة UNT من التحليل داخل مشية GFP الإيجابية. تم قياس MFI المرتبط بارتباط الأجسام المضادة الثانوية IgG المترافقة AF 6 47 من أجل القضاء على مضان الخلفية عند تحليل المصل البشري.

تم حساب دلتا MFI عن طريق طرح MFI الخلفية لخلايا التحكم. يعتمد هذا الاختبار القائم على خلية قياس التدفق الخلوي على اكتشاف الأجسام المضادة لمستضد سطح الخلية ذي الأهمية. على سبيل المثال ، أظهرت خلايا GK 2 93 التي تم نقلها مع تعبير البلازميد ل N-M-D-A-R تعبيرا عاليا عن السطح ومستقبلات الميثيل.

وبالمثل ، عبرت الخلايا المنقولة D اثنان R عن مستقبلات الدوبامين الثانية ، في حين أن الخلايا الخاضعة للرقابة لم تعبر عن أي من هذه المستضدات. قيمت هذه الدراسة السريرية مجموعة من المرضى المصابين بالتهاب الدماغ N-M-D-A-R ، ومجموعة من المرضى مصابين بالتهاب الدماغ المرتبط بالأجسام المضادة D two R ومجموعة تحكم مع أمراض عصبية أخرى غير التهابية. لاحظ أن أيا من المرضى الإيجابيين لم يكن إيجابيا مزدوجا للأجسام المضادة.

استهداف N-M-D-A-R-M-D اثنين R كما هو متوقع. لم يتم الكشف عن الأجسام المضادة N-M-D-A-R و D في أي من الضوابط التي تم تحليلها. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح في غضون خمس ساعات مع ساعة واحدة من اكتساب التدفق لحوالي 80 عينة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة العصبية لاكتشاف أهداف جديدة للأجسام المضادة في الاضطرابات المناعية.