التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة الخصائص الميكانيكية وحالات الطي لشركاء الارتباط في البروتين الاندماجي باستخدام مطيافية القوة للجزيء الواحد القائمة على مجهر القوة الذرية (AFM). ويتم تحقيق ذلك من خلال تثبيت شركاء ارتباط البروتين تساهمياً على شريحة زجاجية وعلى عتلة مجهر القوة الذرية (AFM) لتحقيق هندسة سحب محددة جيداً كخطوة ثانية. يتم ضغط السطح الزجاجي بواسطة العتلة، مما يسمح بتكوين ارتباط بين المستقبل والرابط.

بعد ذلك، يتم سحب العارضة (cantilever) بسرعة ثابتة من أجل بسط نطاقات بروتينية فردية وربط معقد المستقبل والرابط؛ وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها وجود عناصر تركيبية ثالثية تعمل كحواجز طاقة على طول مسار البسط، والتي تظهر في نماذج مرونة البوليمرات. ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات الحركية والطاقية حول الشركاء المرتبطين من خلال مطابقة النماذج الحركية مع طيف القوة الديناميكي. الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة مسارات بسط البروتينات تحت تأثير القوة.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية واضحة حول الاستقرار الميكانيكي للبروتينات. ويمكن تطبيقها على أي نظام بروتيني من المستقبلات والربيطات يمكن هندسته بحيث تكون مجموعة الملفات فيه سهلة الوصول. قد يواجه الباحثون الذين يستخدمون هذه الطريقة لأول مرة بعض الصعوبات لأن التوقيت أمر بالغ الأهمية كما أن التعامل مع الروافع قد يكون صعباً.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الفيزياء الحيوية، مثل كيفية تكشف بروتين متعدد النطاقات. للبدء، ضع شريحتين زجاجيتين غطائيتين بقطر 24 مليمتر وسمك 0.5 مليمتر في حامل A-P-T-E، ثم قم بمعالجة الشرائح بالسونيكة في خليط بنسبة 50 إلى 50 من الإيثانول والمياه فائقة النقاء لمدة 15 دقيقة.

عند اكتمال عملية السونكة، اشطف الشرائح الغطائية بالماء فائق النقاء ثم قم بنقشها في محلول بيرانا لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، أخرج الشرائح الغطائية واشطفها بالماء فائق النقاء وجففها تحت تيار لطيف من النيتروجين. بعد ذلك، اغمر الشرائح الغطائية في خليط بنسبة 45:5:1 من الإيثانول والماء فائق النقاء و 3-aminopropyltrimethoxysilane.

ضع العينات المغمورة على جهاز هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة بسرعة تقريبية تبلغ 50 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، اغمس شريحة الغطاء بالتتابع في ethanol بتركيز 100%، ثم في مياه فائقة النقاء مرتين لكل منهما. وأخيراً، جفف شرائح الغطاء تحت تيار لطيف من النيتروجين.

بمجرد جفافها، قم بتجفيف شرائح التغطية في فرن عند درجة حرارة 80 °C لمدة 30 دقيقة. تُحفظ شرائح التغطية غير المستخدمة تحت غاز الأرجون لمدة تصل إلى ستة أسابيع لإجراء عملية الأمينَة لأطراف العتلات السيليكونية. أولاً، ضع أربعة عتلات سيليكونية على شريحة زجاجية نظيفة وعالجها بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية (UV ozone) لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، تُغمر الروافع (cantilevers) لمدة ثلاث دقائق في محلول يتكون من الإيثانول و 3-amino propyl dimethyl oxis ilene بنسبة 50 إلى 50، مع 0.25% من الماء عالي النقاء. بعد ذلك، تُشطف الروافع بالتتابع لمدة 60 ثانية في أحواض من التولوين والإيثانول والماء عالي النقاء. تُجفف الروافع بعناية على ورق ترشيح بين شطفات متتالية بعد عملية الشطف النهائية.

ضع الروافع على شريحة زجاجية نظيفة وقم بتسخينها عند 80 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. قم بتحضير أنبوبين من خرز TEP diss sulfide المختزل عن طريق قطع طرف رأس ماصة سعة 200 microliter أولاً لتوسيع قطره، ثم سحب 100 microliter من محلول الخرز المخزون ووضعه في كل أنبوب دقيق سعة 1.5 milliliter. بعد ذلك، أضف 1 milliliter من TBS إلى ملاط خرز TEP في الأنابيب، واغسل الخرز عن طريق رج الأنبوب الدقيق لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex.

بعد ذلك، يتم تجميع الحبيبات عن طريق طرد العينات مركزياً عند 850 Gs لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة الراسح بعناية والتخلص منه باستخدام ماصة دقيقة، واغسل الحبيبات مرتين إضافيتين باستخدام 1 mL من TBS. يتم الطرد المركزي بين عمليات الغسل؛ وبعد الغسلة النهائية، أضف محلول بروتين مركز بتركيز 3 mg/mL إلى حبيبات TEP بنسبة واحد إلى اثنين، وامزج المزيج بلطف عن طريق التحريك بطرف ماصة دقيقة لتجنب إدخال فقاعات الهواء.

بعد ذلك، ضع خليط ملاط حبيبات TEP البروتينية على جهاز تدوير لمدة 2.5 hours. انقع كوابل amino eyes والشرائح الغطائية في sodium bate buffer عند pH 8.5 لمدة 45 minutes لإزالة البروتونات من مجموعات الأمين الأولية على السطح. ثم اترك مسحوق N-H-S-P-E-G malam ليدفأ حتى درجة حرارة الغرفة، وقم بتحضير 210 µL منه بتركيز 25 µM عن طريق مزجه بجهاز vortex في sodium boy eight buffer.

يجب استخدام المحلول في أسرع وقت ممكن نظراً لقصر عمر النصف لـ NHS بشكل كبير. وعند pH 8.5، قم بترسيب قطرات بحجم 30 µL من محلول N-H-S-P-E-G malam بسرعة على طبق بتري، و90 µL على كل شريحة غطاء زجاجية أخرى. ضع العتلات (cantilevers) بعناية داخل قطرات الـ 30 µL.

بعد ذلك، اقلب غطاء الشريحة الذي لا يحتوي على قطيرة فوق غطاء آخر يحتوي على محلول N-H-S-P-E-G malam لتشكيل طبقة شطيرة من محلول N-H-S-P-E-G MALAM. وفي المنتصف، يتم تحضين الكابوليات وأغطية الشرائح مع محلول N-H-S-P-E-G MALAM في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم يتم طرد حبيبات TEP ومحلول البروتين المختزل مركزياً عند 100 GS لمدة دقيقة واحدة وجمع الراسب.

بعد ذلك، قم بتخفيف محلول البروتين باستخدام TBS. استهدف تركيزاً للبروتين أثناء الاقتران السطحي يتراوح بين 0.5 و2 ملغم/ملل. ثم اترك محاليل البروتين المختزلة والمخففة جانباً لبضع دقائق أثناء شطف العوارض والشرائح الغطائية.

اشطف شرائح التغطية في ثلاثة بيكرات متتالية من الماء فائق النقاء. أزل السائل المتبقي من شرائح التغطية عن طريق لمس الحواف بعناية بورق الترشيح. ثم ثبت شرائح التغطية في حامل عينات مناسب يتوافق مع جهاز A FM وجفف السائل المتبقي تحت تيار خفيف من النيتروجين.

ضع 20 µL من محلول البروتين المخفف على شكل قطرة في مركز الشرائح الغطائية. بعد ذلك، اشطف الروافع المجهرية (cantilevers) في ثلاثة بيكرات متتالية من الماء فائق النقاء، تليها قطرات بحجم 30 µL من محلول البروتين المخفف الثاني. قم بحضن الشرائح الغطائية المبللنة (pegylated) والروافع المجهرية مع محاليل البروتين المخففة الخاصة بكل منها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين داخل غرفة رطوبة.

بعد ذلك، استخدم ماصة لشطف شرائح الغطاء 10 مرات على الأقل بملليلتر واحد من TBS، ثم احفظها في TBS حتى موعد القياس. كما يجب شطف الروافع (cantilevers) باستخدام ثلاثة كؤوس متتالية تحتوي على TBS لإزالة البروتينات غير المرتبطة، وحفظها في TBS أيضاً. قم بتركيب الروافع والشرائح الزجاجية الوظيفية في جهاز A FM يتناسب مع القياس في السوائل ويدعم نطاق سرعة متاح على المحور Z يتراوح تقريباً من 200 إلى 5,000 نانومتر في الثانية.

عند تركيب العينة لتقليل التعرض للهواء، تأكد من بقاء الأسطح مغطاة بالمحلول المنظم طوال العملية عند ضبط شعاع الليزر بشكل صحيح. اترك النظام ليتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل للحد من أي تأثيرات للانزياح، وأعد الضبط إذا لزم الأمر. بعد ذلك، ابدأ في إجراء القياسات بمجرد نجاح ارتباط التماسك.

تُظهر آثار مسافة القوة المسجلة هنا في زوج Docker نمطاً مميزاً من القمم. تمثل كل قمة في الأثر عملية تفكك نطاق فرعي واحد من البروتين، بينما تقابل القمة الأخيرة تفكك معقد المستقبل والربيطة.

ثم حُوِّلت آثار مسافة القوة المسجلة إلى مساحة طول الكنتور للقوة، وجُمِّعت في مدرج تكراري لموقع الحاجز. وتُظهر البيانات زيادة في طول الكنتور تبلغ حوالي 89 نانومتر، والتي يمكن عزوها بشكل لا لبس فيه إلى تفكك نطاق xin لسبر مخطط الطاقة للـ docker المتماسك والتفاعل. وقد تم الحصول على ما مجموعه 186 أثراً للبيانات عند أربع سرعات سحب مختلفة.

يمثل طيف القوة الديناميكي الناتج، والموضح بدوائر زرقاء كبيرة، أكثر قوى التمزق احتمالية عند معدل تحميل معين. ثم تم مطابقة هذه القيم مع نموذج Bell Evans، وقد أسفرت المطابقة عن قيم لـ Koff و delta X، والتي وُجد أنها تتوافق بشكل جيد مع النتائج المنشورة سابقاً. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجاز الجزء التجريبي منها في غضون ثماني إلى تسع ساعات.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طفرات موجهة لمواقع محددة في تجربة لاحقة لتحديد الأحماض الأمينية الحاسمة للارتباط بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية للجزيء الواحد لاستكشاف مخططات طي البروتين. ونحن نستخدمها لدراسة الخواص الميكانيكية لـ cellulose SOEs، والتي تعد من بين أكثر الأنظمة البروتينية استقراراً ميكانيكياً على الإطلاق.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مطيافية القوة للجزيء المنفرد على أزواج المستقبلات البروتينية والرابطات.