التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة الخواص الميكانيكية وحالات الطي لشركاء ربط بروتين الاندماج باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي القائم على FM. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت شركاء ربط البروتين تساهميا على شريحة زجاجية وعلى ناتئ A FM لتحقيق هندسة سحب محددة جيدا كخطوة ثانية. يتم وضع مسافة بادئة للسطح الزجاجي مع الكابولي ، مما يسمح بإنشاء ارتباط ارتباط المستقبلات.

بعد ذلك ، يتم سحب الكابول بسرعة ثابتة من أجل الكشف عن مجالات البروتين الفردية وربط نتائج معقدة الترابط للمستقبل التي تكشف عن عناصر هيكلية ثلاثية تعمل كحواجز للطاقة على طول المسار المتكشف ، والتي يتم الكشف عنها في نماذج مرونة البوليمر. يمكن الحصول على مزيد من المعلومات الحركية والحيوية حول شركاء الربط من خلال تركيب النماذج الحركية على طيف القوة الديناميكية. الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة المسارات التي تتكشف للبروتينات تحت القوة.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للاستقرار الميكانيكي للبروتينات. يمكن تطبيقه على أي نظام ترابط لمستقبلات البروتين يمكن تصميمه باستخدام مجموعة ملفات يمكن الوصول إليها. الباحثون الذين يستخدمون هذه الطريقة لأول مرة أعاني لأن التوقيت أمر بالغ الأهمية وقد يكون التعامل مع الكابولي أمرا صعبا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزياء الحيوية ، مثل كيفية ظهور بروتين متعدد المجالات لبدء المكان. ينزلق غطاء زجاجي بقطر 24 ملم بسمك 0.5 ملم في حامل A-P-T-F-E ثم صوتي. ينزلق الغطاء في خليط من 50 إلى 50 من الإيثانول والماء عالي النقاء لمدة 15 دقيقة.

عند اكتمال الصوتنة ، اشطف زلات الغطاء بالماء عالي النقاء وحفرها في محلول سمكة الضاري المفترسة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة زلات الغطاء واشطفها بالماء فائق النقاء وجففها تحت تيار لطيف من النيتروجين. الغمر التالي ينزلق الغطاء في خليط من 45 إلى خمسة إلى خليط واحد من الإيثانول ، والماء عالي النقاء ، وثلاثة أمينو بروبيل ثنائي ميثيل أهوي.

ضع عينات الغمر على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة بحوالي 50 دورة في الدقيقة. ثم اغمس زلة الغطاء بالتتابع في 100٪ من الإيثانول ، متبوعا بالماء عالي النقاء مرتين لكل منهما. مرة أخرى ، جفف الغطاء ينزلق تحت تيار لطيف من النيتروجين.

بمجرد أن يجف ، يخبز الغطاء في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتخزين شرائح الغطاء غير المستخدمة تحت الأرجون لمدة تصل إلى ستة أسابيع لإجراء التشكيل الأميني لأطراف ناتئ السيليكون. ضع أولا أربعة ناتئ سيليكون على شريحة زجاجية نظيفة وعالجها بالأوزون فوق البنفسجي لمدة 15 دقيقة.

ثم اغمر الكابولي لمدة ثلاث دقائق ومحلول 50 إلى 50 من الإيثانول وثلاثة أكسيدات بروبيل ثنائي ميثيل الأمينية إيلين ، جنبا إلى جنب مع نقطة 25٪ من الماء عالي النقاء. بعد ذلك ، اشطف الكابولي بالتتابع لمدة 60 ثانية في خبازين التولوين والإيثانول والمياه عالية النقاء. جفف الكابولي بعناية على ورق الترشيح بين RINs بعد الشطف النهائي.

ضع الكابولي على شريحة زجاجية نظيفة واخبزها على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد اثنين من حبات تقليل الكبريتيد TEP عن طريق قطع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر أولا لتوسيع قطرها ثم سحب 100 ميكرولتر من محلول حبة المخزون في كل أنبوب صغير سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من TBS إلى OTTs الملاط بالخرز TEP ، واشطف الخرزات عن طريق دوامة الأنبوب الصغير لفترة وجيزة.

ثم قم بتحبيب الخرزات عن طريق الطرد المركزي للعينات عند 850 Gs لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة دقيقة واشطف الخرزات مرتين أخريين باستخدام مليلتر واحد من TBS. يتم الطرد المركزي بين عمليات الشطف بعد الشطف النهائي ، أضف محلول بروتيني مركز بمعدل ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر إلى حبات TEP بنسبة واحد إلى اثنين واخلط الملاط برفق عن طريق التقليب باستخدام طرف ماصة دقيقة لتجنب إدخال فقاعات الهواء.

ثم ضع خليط ملاط حبة البروتين TEP على محور دوار لمدة 2.5 ساعة. انقع ناتئ العيون الأمينية وقم بتغطية الزلات في عازلة بيت الصوديوم عند درجة حموضة 8.5 لمدة 45 دقيقة لإزالة بروتون مجموعات الأمين الأولية على السطح. ثم قم بتسخين مسحوق N-H-S-P-E-G malam إلى درجة حرارة الغرفة وقم بإعداد 210 ميكرولتر منه عند 25 ميكرومولار عن طريق دوامته في عازلة الصوديوم الثمانية.

يجب استخدام الحل في أسرع وقت ممكن بسبب عمر النصف القصير للغاية ل NHS. عند درجة الحموضة 8.5 ، قم بإيداع 30 ميكرولتر من محلول الملام N-H-S-P-E-G بسرعة على طبق بتري و 90 ميكرولترا على كل زلة غطاء زجاجي أخرى. ضع الكابولي بحذر داخل قطرات 30 ميكرولتر.

ثم اقلب زلة الغطاء بدون القطرة على واحدة باستخدام محلول N-H-S-P-E-G malam لتشكيل شطيرة بمحلول N-H-S-P-E-G MALAM. في المنتصف ، احتضن الكابول وقم بتغطية الزلات بمحلول N-H-S-P-E-G MALAM في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. الطرد المركزي حبة TEP ومحلول البروتين المخفض عند 100 GS لمدة دقيقة واحدة وجمع snat.

بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول البروتين باستخدام TBS. استهدف تركيز البروتين أثناء اقتران السطح في نطاق يتراوح من 0.5 إلى ملليغرام لكل ملليلتر. ثم ضع محاليل البروتين المخففة والمخففة جانبا لبضع دقائق أثناء شطف الكابولي وغطاء الزلات.

اشطف زلات الغطاء بثلاث أكواب متتالية من الماء عالي النقاء. قم بإزالة السائل المتبقي من زلات الغطاء عن طريق لمس الحواف بعناية لترشيح الورق. ثم قم بتركيب زلات الغطاء في حامل عينة مناسب متوافق مع أداة A FM والسائل المتبقي الجاف تحت تيار لطيف من النيتروجين.

ضع 20 ميكرولترا من محلول البروتين المخفف كقطرة على منتصف زلات الغطاء. ثم اشطف الكابولي في ثلاثة أكواب متسلسلة من الماء عالي النقاء ، متبوعا ب 30 قطرة ميكرولتر من محلول البروتين المخفف الثاني. احتضان زلات الغطاء والناتئ مع محاليل البروتين المخففة الخاصة بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين في غرفة الرطوبة.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لشطف زلات الغطاء 10 مرات على الأقل باستخدام مليلتر واحد من TBS ثم قم بتخزينها في TBS حتى القياس. اشطف الكابولي أيضا باستخدام ثلاث أكواب متسلسلة تحتوي على TBS لإزالة البروتينات غير المرتبطة وتخزينها في TBS أيضا. قم بتركيب الشرائح الوظيفية والناتئة والزجاجية في نموذج A FM المناسب للقياس في السوائل ويدعم نطاق سرعة يمكن الوصول إليه على Z pieto من حوالي 200 إلى 5,000 نانومتر في الثانية.

عند تركيب يمكن أن يقلل من التعرض للهواء ، تأكد من بقاء الأسطح مغطاة بمخزن مؤقت أثناء العملية برمتها عند الضبط الصحيح لشعاع الليزر. دع النظام يتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل لتقليل أي تأثيرات انجراف وإعادة الضبط إذا لزم الأمر. ثم ابدأ في أخذ القياسات عند الارتباط الناجح للتماسك.

عامل الإرساء في زوج آثار مسافة القوة المسجلة الموضحة هنا. إظهار نمط الذروة المميز. تمثل كل ذروة في التتبع ظهور مجال فرعي واحد للبروتين مع الذروة الأخيرة المقابلة لتفكك مركب ترابط المستقبل.

ثم تم تحويل آثار مسافة القوة المسجلة لقوة مساحة طول الكفاف وتجميعها في رسم بياني لموضع الحاجز. تظهر البيانات زيادة في طول الكفاف تبلغ حوالي 89 نانومتر ، والتي يمكن تخصيصها بشكل لا لبس فيه لتكشف مجال xin لاستكشاف مشهد الطاقة لعامل الإرساء المتماسك والتفاعل. تم الحصول على ما مجموعه 186 تتبعا للبيانات بأربع سرعات تجميع مختلفة.

يمثل طيف القوة الديناميكية الناتج الموضح على شكل دوائر زرقاء كبيرة قوى التمزق الأكثر احتمالا بمعدل تحميل معين. ثم تم تركيب هذه القيم على نموذج Bell Evans ، حيث أسفرت القيم الملائمة ل Koff و delta X ، والتي وجد أنها تتفق بشكل جيد مع النتائج المنشورة سابقا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بالجزء التجريبي من هذه التقنية في ثماني إلى تسع ساعات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الطفرات الخاصة بالموقع في تجربة متابعة لتحديد الأحماض الأمينية الحاسمة للارتباط بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية للجزيء الواحد لاستكشاف المناظر الطبيعية القابلة للطي للبروتين. نستخدمه لدراسة الخواص الميكانيكية للشركات المملوكة للسليلوز ، والتي تعد من بين أكثر أنظمة البروتين استقرارا ميكانيكيا المعروفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي على أزواج ترابط مستقبلات البروتين.