عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الشجيرية والخلايا الظهارية من الغدة الزعترية البشرية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تفتيت النسيج المستأصل من خلال التقطيع الميكانيكي. بعد ذلك، يتم هضم شظايا النسيج إنزيميًا لإنتاج معلق من الخلايا المفردة.

أخيراً، يتم إثراء معلق الخلايا بكسر الخلايا منخفض الكثافة عن طريق الفصل باستخدام Percoll. وفي النهاية، يمكن عزل الخلايا الشجرية والخلايا الظهارية من هذا الكسر عن طريق الفرز المغناطيسي أو الفرز بتنشيط الفلورة (FACS)، أو مزيج من كليهما. توفر الطريقة التي نقدمها هنا إجراءً فعالاً وقابلاً للتكرار ومنخفض التكلفة للعزل الناجح والدراسة اللاحقة لمجموعات الخلايا النادرة مثل الخلايا الشجرية والخلايا الظهارية التيموسية الموجودة في التيموس البشري.

سيقوم روتّا، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا، بتوضيح الإجراء لك. ابدأ بوضع نسيج الغدة الزعترية في طبق بتري يحتوي على PBS معقم في درجة حرارة الغرفة، واغسل أي بقايا دم. بعد ذلك، أضف PBS طازجاً إلى طبق بتري واستخدم الملاقط والمقص لإزالة أي جلطات دموية، وأنسجة ضامة ودهنية، وأي أجزاء من النسيج التي لا تبدو سليمة.

بمجرد تنظيف نسيج الغدة الزعترية، قم بوزنه كمرجع ثم قطع النسيج إلى قطع متساوية الحجم تبلغ سعتها سنتيمتر مكعب واحد. الآن غطِّ القطع بـ PBS وضعها على الثلج. بعد ذلك، استخدم الجزء الخلفي من مكبس سرنجة معقمة سعة 10 إلى 20 milliliter لتطبيق ضغط خفيف وسريع على النسيج لإزالة الكتلة الرئيسية من الخلايا الزعترية وتقليل الحجم الإجمالي للنسيج المراد هضمه.

سيصبح المحلول عكراً بشكل ملحوظ. وعند تحرر الخلايا التيموسية، حرّك الطبق بلطف ثم استخدم شفاطاً زجاجياً لإزالة السائل الطافي المحتوي على الخلايا التيموسية، مع الحرص على عدم شفط قطع النسيج عن طريق الخطأ. قد يكون من المفيد استخدام كاشطة مزارع خلوية معقمة لتجميع كل قطع النسيج في جانب واحد من الطبق، ثم إمالة الطبق بزاوية 45 درجة وشفط ما تبقى من السائل الطافي.

اشطف الطبق بمحلول PBS طازج واستمر في جمع السائل العلوي حتى يصبح محلول PBS شفافاً نسبياً. قم بإجراء غسلة نهائية باستخدام وسط RPMI، ثم استخدم مقصاً حاداً لتقطيع قطع الأنسجة إلى أصغر قطع ممكنة، على أن تكون صغيرة بما يكفي على الأقل للدخول في ماصة سعة خمسة ملليلتر لعزل الخلايا التغصنية أو dc. أولاً، ضع ما يصل إلى 10 جرامات من قطع الأنسجة المفرومة في أنابيب سعة 50 ملليلتر، مع إضافة 10 ملليلتر من محلول collagenase DNA و 10 ملليلتر من وسط RPMI لكل خمسة جرامات من الأنسجة.

بعد ذلك، يتم تحضين معلق النسيج لمدة 40 دقيقة مع التدوير البطيء في حاضنة حرارية عند 37 degrees Celsius. سيصبح محلول الإنزيم عكراً مع تحرر الخلايا فيه. وفي نهاية عملية الهضم، يتم طرد معلق الخلايا مركزياً لمدة دقيقتين عند 110 G وفي درجة حرارة الغرفة لترسيب شظايا النسيج، ثم يتم جمع المادة الطافية ومن ثم تجميع معلق الخلايا في صورة كريّة.

تخلص هذه المرة من الطافي وأعد تعليق الخلايا في 10 إلى 50 ملليلتر من وسط RPMI الكامل. وبناءً على حجم الراسب، حدد عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد صبغة tripan blue، ثم ضع معلق الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع ترك الغطاء مرتخياً لعزل الخلايا الظهارية الزعترية أو t. بعد ذلك، أعد تعليق بقايا الأنسجة في 10 ملليلتر من محلول collagenase DNA الطازج، بالإضافة إلى 10 ملليلتر من وسط RPMI و trypsin EDTA.

استكمل عملية هضم قطع الأنسجة لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التدوير اللطيف. وخلال آخر 10 إلى 15 دقيقة من فترة الحضانة، أضف مصل العجل الجنيني بنسبة واحد إلى خمسة لمعادلة تأثير التربسين. بعد تجميع قطع الأنسجة في صورة كرة راسبة، اجمع السائل الطافي ثم قم بطرد معلق الخلايا مركزياً مرة أخرى.

هذه المرة، قم بسحب السائل الطافي بعناية والتخلص منه، مع الحرص على الحفاظ على الراسب الرخو. بعد عد عدد الخلايا الحية، ضع معلق الخلايا هذا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أيضاً. ولإثراء جزء الكثافة المنخفضة أو خلايا LDF، ابدأ بترسيب معلقات الخلايا التي تم عزلها مسبقاً لإثراء DC وtech أثناء عملية دوران الخلايا لترسيبها.

قم بإعداد تدرج كثافة Percoll بتركيز 1.07 جرام لكل ملليلتر. وفقاً لهذا الجدول، قم بإعادة تعليق كلا الراسبين حتى يصل التركيز إلى 1 × 10⁹ خلية في 6 ملليلتر من محلول Percoll المُحضّر. اخلط محلول الخلايا بشكل كافٍ للحصول على معلق متجانس، ثم انقل المحاليل إلى أنابيب طرد مركزي من البوليكربونيت ذات غطاء لولبي من نوع Oakridge سعة 50 ملليلتر.

بعد ذلك، استخدم ماصة لإضافة 30 milliliters من وسط RPMI الكامل لكل أنبوب ببطء على شكل طبقة فوق معلق خلايا perca. مع الحرص على عدم خلط الطبقات، انقل الأنابيب بعناية إلى جهاز طرد مركزي مبرد مسبقاً مزود بدوار ثابت الزاوية، وقم بفصل الخلايا لمدة 35 minutes. ثم استخدم مصاصات خلفية معقمة لنقل أجزاء الخلايا ذات الكثافة المنخفضة المثرية بعناية من الواجهة الفاصلة بين خلايا per والوسط إلى أنابيب سعة 50 milliliter تحتوي على وسط RPM كامل مبرد.

بعد ذلك، أقوم بملء الأنابيب بكمية إضافية من وسط RPMI الكامل لتخفيف المتبقي لكل خلية. وأخيراً، يتم غسل الخلايا المثرية مرتين باستخدام وسط RPMI الكامل، ثم إعادة تعليق الراسب في وسط طازج وتحديد عدد الخلايا الحية. يظهر في هذا الشكل الأول قطعة كبيرة نسبياً من الأنسجة بطول تسعة سنتيمترات تم الحصول عليها من طفل يبلغ من العمر 6 سنوات، كما تم توضيحه للتو.

تتمثل الخطوة الأولى الهامة في تنظيف النسيج من الأجزاء غير المرغوب فيها. وكما تشير الأسهم البيضاء، تم الحصول بعد ذلك على معلق خلوي أحادي من نسيج التيموس وإثرائه بخلايا الجزء منخفض الكثافة. وبينما يحتوي المعلق الخلوي الأحادي النموذجي على حوالي 3% من الخلايا الموجبة لـ H-L-A-D-R بعد الفصل بتدرج الكثافة، تزداد هذه النسبة لتصل إلى 15 إلى 40% في الخلايا كبيرة الحجم.

الجزء منخفض الكثافة في الجزء عالي الكثافة، والذي يتكون أساساً من خلايا تيموسية صغيرة الحجم ومنتظمة. لا توجد فعلياً مثل هذه الخلايا التيموسية.

يمكن تحديد الخلايا التغصنية النخاعية من خلال التعبير عن عدد من المؤشرات السطحية، بما في ذلك CD 11 C. يوضح هذا الشكل العزل الفعال للخلايا الموجبة لـ CD 11 C باستخدام بروتوكول معدل لفصل الخلايا مغناطيسياً بعد العزل. بلغت نقاوة الخلايا التغصنية الموجبة لـ CD 11 C نسبة 93% كما تم تحديده عن طريق التلوين المناعي للخلايا المعزولة. وفي المتوسط، يتراوح استرداد الخلايا الموجبة لـ CD 11 C المعزولة بين 5 × 10⁵ إلى 5 × 10⁶ من الخلايا التغصنية النخاعية لكل 10⁹ من إجمالي خلايا التيموس.

يوضح هذا الجدول بيانات تمثيلية تم الحصول عليها من عدة عينات فردية من الغدة الزعترية لأعمار وأوزان أنسجة مختلفة وبنطاقات متنوعة من معلقات الخلايا المفردة المدخلة، بالإضافة إلى إجمالي أعداد خلايا الجزء منخفض الكثافة، وعائد ونقاء الخلايا الموجبة لـ CD 11 C اللاحق في الجزء المخصب بالخلايا المقدمة للمستضد فقط. حوالي 0.5% من الخلايا هي خلايا ظهارية قشرية موجبة لـ CD 45 و EPCA المنخفض، أو موجبة لـ EPAM وسالبة لـ CD 45، ويمكن فرز الخلايا الظهارية النخاعية من الخلايا السدوية المخصبة السالبة أو المنخفضة لـ CD 45 والمهضومة بالتريبسين كخلايا موجبة لـ epam المنخفض و CDR 2، وخلايا سالبة لـ CD 2 وموجبة لـ epam المرتفع على التوالي. عزل الخلايا التغصنية والمجموعات الفرعية للخلايا الظهارية الزعترية من الغدة الزعترية البشرية.

تعتبر هذه العملية حساسة للوقت؛ فكلما كان إجراء الفصل أسرع، كانت حالة الخلايا أفضل. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن عزل الخلايا الشجرية في غضون خمس إلى ست ساعات، والخلايا الظهارية التيموسية في غضون ثمان إلى 10 ساعات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو اليوم، يجب أن يتكون لديك فهم جيد جداً لكيفية التعامل مع أنسجة الغدة الزعترية البشرية من أجل العزل الناجح للخلايا الشجرية والخلايا الظهارية الزعترية. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة في العديد من التطبيقات اللاحقة للدراسات التالية، وذلك من أجل إجراء توصيف أدق لهذه الخلايا وفهم بيولوجيتها بشكل أفضل.