رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

الهدف العام من التجربة التالية هو القياس الكمي لهجرة الخلايا الجارية نحو تدرج من الكيموكينات. في ظل ظروف إجهاد القص الفسيولوجي، يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة طبقة أحادية من الخلايا البطانية على إدراجات دقيقة المسام مطلية بالكولاجين، ثم تجميعها في غرفة تدفق حيث تغطي حجرة ساكنة منفصلة تحتوي على الكيموكينات. بعد ذلك، يتم تطبيق إجهاد القص على الخلايا لمحاكاة الظروف الفسيولوجية في الأوعية الدموية.

كخطوة ثانية، تُترك الخلايا المراد اختبارها، مثل الخلايا الجذعية للكريات البيضاء أو الخلايا الورمية، لتتدفق داخل النظام ثلاثي الأبعاد أثناء عملية الدوران. وتؤثر المحتويات الموجودة في الحجرة الساكنة على كفاءة التفاعلات بين الخلايا المتدفقة والخلايا البطانية، وبالتالي تؤثر على معدل الهجرة عبر البطانية للخلايا المختبرة عبر الطبقة البطانية. بعد ذلك، يتم تفكيك النظام ثلاثي الأبعاد وجمع الخلايا المختبرة التي هاجرت من الحجرة الساكنة السفلية من أجل قياس الخلايا كمياً باستخدام طرق متطورة مختلفة، ويتم الحصول على نتائج توضح قدرة الخلايا المختبرة المتدفقة على التفاعل مع الخلايا البطانية تحت ظروف التدفق الفسيولوجي والخروج من الدورة الدموية بناءً على تركيز الكيموكينات في الحجرة الساكنة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام غرف تدفق الصفائح المتوازية ومقايسات النقل الساكنة، في أنها تجمع بين إجهاد القص في الحجرة العلوية والـ kines في الحجرة الساكنة السفلية. وهذا يتيح للباحثين قياس خارجية الخلايا الدوارة تجاه تدرج الـ kin وظروف التدفق الفسيولوجي بشكل كمي. كما يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تأثير التواصل المتبادل بين خلايا البيئة الدقيقة المحلية والخلايا البطانية على ارتشاح الخلايا الدوارة.

من خلال دعم طبقة إضافية من الخلايا على قطعة إدراج منفصلة أسفل الخلايا البطانية، ستقوم فالنتينا ضد روفا، وهي فنية من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. للبدء، احسب عدد قطع الإدراج المطلوبة للتجربة وضع كل قطعة في طبق بتري معقم ومنفصل. قم بتعقيمها عن طريق التشعيع بغاما حتى تصل الجرعة الإجمالية إلى 11 gray بناءً على التجهيزات الفردية.

بعد ذلك، قم بتخفيف محلول كولاجين من النوع الأول (stock collagen Type one solution) ليصل تركيزه إلى 50 micrograms per milliliter باستخدام حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.01 molar والمحفوظ عند درجة حرارة 4 °C، ثم جهز حصصاً (aliquots) بحجم 154 microliter من المحلول النهائي لكل قطعة إدراج (insert). بعد ذلك، ضع عدة قطرات من المحلول على سطح قطعة الإدراج بنمط دائري.

ثم أضف بقية الجزء المقسم لتكوين قطرة كبيرة واحدة على سطح الغشاء. تأكد من عدم ملامسة طرف الماصة للغشاء في أي نقطة، وأن يغطي الكولاجين كامل سطح الغشاء دون أن يتسرب بعيداً. وبمجرد تغطية الغشاء، ضع الغطاء على طبق بتري وضعه بعناية على سطح مستوٍ.

قم بتحضين القطع المدرجة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، اسحب محلول الكولاجين واغسل الغشاء بـ 160 µL من PBS. ثم اسحب الـ PBS. أعد وضع الغطاء ولف الطبق بورق البارافورم.

إذا كان سيتم استخدام الحشوات في اليوم نفسه، فضع طبق بتري في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة. وخلاف ذلك، ضع الطبق في درجة حرارة 4 °C واستخدم الحشوة في غضون سبعة أيام. قم بحصد الخلايا البطانية لوريد السرة البشري المستزرعة مباشرة قبل الاستخدام، وأعد تعليقها في وسط الاستزراع المطلوب بتركيز 2.5 million cells per milliliter.

عند عد الخلايا، تأكد من أن حيوية الخلايا تزيد عن 98% باستخدام tripan blue، ثم أضف 160 µL من معلق الخلايا على كل قطعة إدراج (insert). يتم ذلك من خلال وضع عدة قطرات صغيرة أولاً على سطح قطعة الإدراج المغطاة بالكولاجين بشكل دائري، ثم إضافة بقية معلق الخلايا بعناية لتشكيل قطرة واحدة كبيرة. عند الانتهاء، أعد الأغطية وثبت الأطباق بعناية في حضانة تحتوي على 5% carbon dioxide عند 37 °C واتركها لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بالغشاء.

بعد مرور 30 دقيقة، أخرج الأطباق من الحاضنة وأضف بلطف خمسة ملليلترات من وسط استزراع مُدفأ مسبقاً فوق كل قطعة إدراج (insert). مع الحرص على ضمان بقاء قطعة الإدراج في قاع الطبق وتغطيتها بالكامل بالوسط. ثم أعد وضع الأغطية وأرجع الأطباق بعناية إلى حضانة الاستزراع.

تُحضن الخلايا عند 37 درجة Celsius طوال الليل. لتجميع غرفة التدفق، ابدأ أولاً بربط الصفيحتين العلوية والسفلية معاً. ثم قم بتوصيل الصفائح بوحدة التبادل الغازي باستخدام أنابيب PVC بقطر داخلي 1.42 millimeter وجدران بسمك 0.8 millimeter.

بعد ذلك، ضع الجهاز المجمّع في كيس بلاستيكي نظيف وعقمه عن طريق التشعيع بأشعة جاما حتى تصل الجرعة الإجمالية إلى 11 gray. والخطوة التالية هي إخراج صينية الحاضنة، ووضعها داخل غطاء استنبات أنسجة معقم وتعقيمها بـ 70%ethanol. ثم غطِّ الصينية بمنديل معقم كبير.

بعد ذلك، أخرج الجهاز من الكيس البلاستيكي وضعه على صينية الحاضنة المعقمة. ثم قم بتوصيل الجهاز بالمضخة 연동ية (peristaltic pump) وبرمج المضخة لتعمل بسرعة 0.2 milliliters per minute. استخدم الماصة لنقل من خمسة إلى سبعة milliliters من وسط الزرع المطلوب إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter ليستخدم كمدخل.

بعد ذلك، افصل أنبوب المدخل عن المخرج عن طريق سحب الإبرة المعدنية من الأنبوب باستخدام مناديل معقمة صغيرة للحفاظ على تعقيم الأنبوب، ثم ضع إبرة المدخل المعدنية في أنبوب سعة 15 milliliter الذي يحتوي على الوسط الزراعي، وضع أنبوب المخرج في أنبوب سعة 15 milliliter فارغ. بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة بحيث يكون التدفق عكس اتجاه عقارب الساعة. اترك الضغط السلبي يسحب الوسط من أنبوب المدخل سعة 15 milliliter إلى داخل الأنابيب، وأوقف تشغيل المضخة عندما يصل الوسط إلى نهاية الأنبوب مباشرة قبل دخوله إلى الجهاز.

بعد ذلك، افتح الجهاز عن طريق فك صفائح الأنابيب وقم بإزالة الصفيحة العلوية بعناية، ثم استخدم الماصة لنقل من 1500 إلى 1550 microliters من الوسط إلى الآبار السفلية، مع التأكد من احتواء الآبار على كمية كافية من الوسط لتكوين نصف كرة يصل ارتفاعها إلى واحد إلى اثنين millimeters فوق الصفيحة السفلية. بعد ذلك، انقل الحشوات المُحضرة من أطباق بتري إلى آبار الصفيحة السفلية. وباستخدام ملقط معقم، تأكد من عدم وجود فقاعات محبوسة أسفل الحشوات، وقم بشفط أي وسط يظهر على سطح الصفيحة السفلية.

بعد ذلك، ضع اللوحة العلوية مرة أخرى فوق اللوحة السفلية وأعد توصيلهما. وباستخدام البراغي، قم بتشغيل المضخة 연동ية (peristaltic pump) على الفور واسمح للوسط بالتدفق عبر الجهاز ثلاثي الأبعاد. ارفع الطرف المخرج للجهاز وحافظ على الغرفة في هذا الوضع لمنع تكون فقاعات داخل المساحة الموجودة بين اللوحتين.

استمر في ملء الأنبوب الذي يربط الغرفة بوحدة التبادل الغازي بالوسط حتى يصل إلى وحدة التبادل الغازي. بعد ذلك، ضع 3 mL من الوسط في وحدة التبادل الغازي. قم بتشغيل المضخة واسمح لفقاعات الهواء بالخروج من خلالها.

ارفع الوحدة للسماح للوسط بملء الأنبوب الذي يخرج منها، وأوقف المضخة عندما يصل الوسط إلى مسافة سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات قبل النهاية. وبمجرد إتمام عملية التحضير بالكامل، قم بتوصيل إبرة المدخل بأنبوب المخرج باستخدام مناديل معقمة صغيرة. بعد ذلك، اعكس اتجاه المضخة بحيث يتدفق الوسط في اتجاه عقارب الساعة نحو وحدة التبادل الغازي، وتأكد من إزالة أي فقاعات هواء متبقية.

مع استمرار تدفق المضخة في اتجاه عكس عقارب الساعة، أضف 100 µL من معلق الخلايا المختبرة إلى وحدة التبادل الغازي. ثم أغلق غطاء جهاز التنفس.

أعد الصينية إلى الحاضنة واترك الخلايا المختبرة تتدفق داخل الجهاز عند 37 °C. بمجرد انقضاء الوقت المطلوب، أخرج الصينية التي تحتوي على النظام التشغيلي من الحاضنة وضعها داخل غطاء التدفق الصفائحي. أوقف تشغيل المضخة، وافصل أنبوبي المدخل والمخرج، ثم ضع الطرفين في أنابيب معقمة فارغة سعة 15 mL.

ثم قم بتشغيل المضخة وجمع معلق الخلايا من النظام. ضع معلق الخلايا على الثلج حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، قم بتفكيك الغرفة عن طريق إزالة البراغي ورفع اللوح العلوي.

قم بإزالة الحشوات من الطبقة السفلية وانقلها إلى أطباق بتري للتلوين أو لجمع الخلايا. وأخيراً، قم بإزالة معلق الخلايا من الآبار السفلية وضعه في أنابيب سعة 15 milliliter. اشطف كل بئر مرتين باستخدام 1.5 milliliters من الوسط المزرعي وأضفه إلى الأنبوب المخصص له.

بعد ذلك، يتم طرد الأنابيب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 200 Gs ومعالجة الخلايا وفقاً لأهداف تجريبية محددة مثل تلك المدرجة في بروتوكول النص المرفق الموضح. إليكم مثالاً على أحد الاختبارات العديدة التي يمكن إجراؤها باستخدام هذا النظام. يتكون الإعداد من محاكاة للخلايا البطانية المشتقة من نخاع العظم والنامية على غشائين بمسام بحجم خمسة ميكرون، حيث تمت إضافة العامل المشتق من الخلايا السدوية 1 أو SDF1 تحت الغشائين بتركيزات 0 أو 5 أو 50 ng/mL.

سُمح لخلايا نخاع العظم بالدوران في النظام ثلاثي الأبعاد. جُمعت الخلايا التي هاجرت عبر الغشاء المنسدل، ثم زُرعت في أطباق تحتوي على وسط ميثيل سليلوز (Methylcellulose). وفي ظل وجود عوامل نمو مكونة للدم تحفز الخلايا السلفية على تكوين مستعمرات، تم حساب عدد المستعمرات بعد 14 يوماً لتحديد عدد الخلايا السلفية في كل بئر والكشف عن قدرتها على الهجرة نحو sdf.

أحدهما تحت ظروف التدفق الفسيولوجي. ومع إضافة الخلايا الليفية السدوية التي نمت على الغرسة السفلية في الغرفة الساكنة، هاجرت المزيد من الخلايا المكونة للدم من الدورة الدموية إلى الغرفة عند إضافة sdf-1 بتركيز 50 nanograms per milliliter مقارنةً بإضافة SDF-1 وحدها. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مختلف مجالات العلوم الطبية والبيولوجية لنمذجة الأسرة الوعائية الخاصة بالأنسجة في المختبر (in vitro) واستكشاف الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط هجرة الخلايا الدوارة نحو الأنسجة السليمة مقابل الأنسجة المصابة.