الإنتاجية العالية فلوروميتريك قياس التربة المحتملة خارج الخلية أنزيم الأنشطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير أقصى معدلات محتملة تقوم من خلالها الإنزيمات خارج الخلوية في التربة بتفكيك الركائز المستهدفة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق خلط التربة الرطبة الحقلية والمحلول المنظم في خلاط، ثم نقل العينات المختلطة بواسطة الماصة إلى لوحة عينات ذات آبار عميقة ولوحات قياسية ذات آبار عميقة. يتم تحضين الألواح ذات الآبار العميقة وطردها مركزياً قبل نقل 250 µL من كل بئر من الألواح ذات الآبار العميقة إلى الآبار المقابلة في ألواح سوداء ذات قاع مسطح.

أطباق ذات 96 بئراً. ثم تُقرأ الأطباق الثلاثة باستخدام مقياس الفلورية وتُحلل البيانات الناتجة. وفي النهاية، يتم تحديد أنشطة الإنزيمات خارج الخلوية المحتملة في التربة من خلال معدل تحرر الصبغة الفلورية من المادة الركيزة عبر تفاعل محفز إنزيمياً، حيث تشير الفلورية الأعلى إلى زيادة تحلل المادة الركيزة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في القدرة على قياس أنشطة الإنزيمات في عدد كبير من العينات من خلال الاستفادة من تنسيق الأطباق الدقيقة ذات الـ 96 بئراً العميقة. لقد جاءت فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما رأينا فرصة لزيادة حجم العينة مقارنة بالأطباق الدقيقة القياسية عن طريق تطويع البروتوكولات الأخرى لتتناسب مع تنسيق الأطباق ذات الآبار العميقة. وتسمح لنا تداعيات هذه التقنية بربط الفسيولوجيا الميكروبية بشكل أفضل بالعمليات على مستوى النظام البيئي.

يُعد العرض المرئي أمراً بالغ الأهمية لهذه التقنية نظراً لوجود العديد من التفاصيل الدقيقة وطرق التعامل مع العينات التي يصعب اتباعها في إجراء مكتوب. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الإيكولوجيا الميكروبية والكيمياء الحيوية الجيولوجية للتربة، مثل كيفية استجابة ميكروبات التربة للتغيرات في بيئتها، وكيف تؤثر استجاباتها الفسيولوجية على عمليات النظام البيئي الحرجة، مثل التحلل ودورة المغذيات. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تحلل المادة العضوية في التربة ودورة المغذيات في النظم البيئية البرية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على الأنظمة البحرية وأنظمة المياه العذبة.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في استخدام هذه الطريقة صعوبة في مهارات الماصّة ومسائل الحساسية الزمنية المتعلقة بهذا البروتوكول. علاوة على ذلك، فإن الكمية الكبيرة من البيانات الناتجة عن هذا الإجراء قد تكون مربكة أحياناً لمستخدمي المرة الأولى. لبدء إعداد المقايسة، قم بتسمية ثلاث أطباق ذات آبار عميقة على أنها sample MUB standard لـ four methyl و beone و MUC standard لـ seven amino four methyl coumarin.

صب كل معيار ومادة تفاعل في خزانات منفصلة نظيفة وموسومة مسبقاً وموزعة في صفوف. بعد ذلك، انقل باستخدام الماصة معيار MUB المناسب إلى الآبار المقابلة في لوحة معايير MUB كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. كرر هذه العملية لمعايير MUC في الآبار المقابلة في لوحة معايير MUC لتحضير ملاط التربة.

لكل عينة تربة، قم بوزن 2.75 grams من التربة الرطبة الميدانية قبل إضافتها إلى الخلاط. أضف 91 milliliters من محلول منظم بتركيز 50 millimolar، ثم اخلط على سرعة عالية لمدة دقيقة واحدة. صب محتويات الخلاط في وعاء زجاجي نظيف لا يقل عرضه عن عرض ماصة ثمانية القنوات مع وضع قضيب تحريك مغناطيسي.

يمكن تصفية ملاط التربة باستخدام مصفاة بقطر حوالي 1 ملم قبل صبه في الوعاء. ضع الوعاء على لوحة تحريك وقم بخلط ملاط التربة. بعد ذلك، اسحب 800 µL من ملاط التربة باستخدام الماصة وضعها في العمود الأول من لوحة العينات.

كرر نفس الخطوات للعمود الأول من أطباق معيار MUB وأطباق معيار MUC. اشطف الخلاط، ولوح التحريك، وقضيب التحريك بالماء منزوع الأيونات أو بالمحلول المنظم بين عينات التربة. كرر هذه العملية لكل عينة تربة.

الانتقال إلى العمود التالي مع كل عينة لاحقة. بعد ذلك، يتم نقل الركيزة المناسبة باستخدام الماصة إلى الآبار المقابلة في لوحة العينات. وكما هو موضح في البروتوكول النصي، يتم تحضير لوحة عينات لكل درجة حرارة تحضين سيتم اختبارها.

أغلق ألواح الآبار العميقة باستخدام الحصائر المخصصة للألواح. اقلب كل لوح مُغلق يدويًا حتى يتم خلط المحلول جيدًا. ضع الألواح في الحاضنة المناسبة للفترة الزمنية المطلوبة للتحضين كما هو مدرج في البروتوكول النصي، وسجل الوقت الأولي باعتباره الزمن صفر، بالإضافة إلى أوقات التحضين المناسبة في نهاية كل فترة تحضين.

قم بطرد مركزي للأطباق المختومة لمدة ثلاث دقائق عند 2,900 G تقريباً. بعد الطرد المركزي، انقل 250 µL من كل بئر من أطباق الآبار العميقة المحضونة إلى الآبار المناظرة في أطباق 96 بئراً سوداء ذات قاع مسطح. يُستخدم طبق أسود واحد لكل طبق آبار عميقة محصون.

من المهم نقل العينات من أطباق الآبار العميقة التي تم تحضينها إلى الآبار المقابلة في أطباق 96 بئراً ذات القاع الأسود والمسطح، وذلك وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لجهاز قارئ الأطباق الفلورومتري المستخدم. اضبط طول موجة الإثارة على 365 nanometers وطول موجة الانبعاث على 450 nanometers.

قم بتحميل إحدى الأطباق القياسية، واضبط مقياس الفلورية على كسب تلقائي (automatic gain) واقرأ الطبق. بعد ذلك، اضبط الكسب على يدوي وقم بتقليل القيمة من المستوى الأمثل إلى الرقم الأدنى التالي مقربًا إلى أقرب خمسة. لكل طبق قياسي، كرر القياس مرتين لكل طبق.

بعد ذلك، قم بتحميل لوحة العينات. اضبط الكسب (gain) على الوضع التلقائي وقم بتشغيل لوحة العينات. أعد تشغيل لوحة العينات يدوياً لمطابقة أعلى قيمة كسب لكل لوحة من اللوحات القياسية.

ابدأ تحليل البيانات بإدخال بيانات فلورية المنحنى القياسي لـ MUB و MUC في جدول بيانات. قم بتحويل التركيزات الميكرومولارية إلى ميكرومولات لكل عينة. وبناءً على بيانات فلورية المنحنى القياسي، احسب الميل والجزء المقطوع من محور y وقيم R squared لتركيزات MUB و MUC القياسية.

يجب أن تتجاوز قيم r squared المقبولة 0.98 لكل عينة. يمكن تصور منحنيات المعايرة في مخطط تشتت، حيث يتم تمثيل قراءات الفلورسنت كمتغير تابع، وتركيز المعيار كمتغير مستقل. أدخل بيانات الفلورسنت الخام للعينة بالإضافة إلى الركيزة في جدول بيانات جديد.

قم بتضمين وقت الحضن والوزن الجاف للتربة لكل عينة، واطرح قيم تقاطع المنحنى القياسي من قيم الفلورة المقابلة للعينة، ثم اقسم الناتج على ميل المنحنى القياسي المقابل. باستخدام معادلة الخط القياسي، اضرب ميكرومولات العينة في 91 milliliters، وهي حجم المنظم المستخدم في ملاط التربة. اقسم القيمة التي تم الحصول عليها على وقت الحضن الخاص بالعينة وكتلة التربة الجافة.

أخيراً، اضرب القيمة التي تم الحصول عليها في 1000 للحصول على الوحدات المطلوبة. تظهر النتائج من دراسة مناخية تجريبية تقارن بين التربة التي تعرضت لظروف المناخ المحيط والتربة التي تعرضت لمعاملات رفع نسبة ثاني أكسيد الكربون والتسخين؛ وتوضح النتائج المعروضة هنا أنشطة الإنزيمات خارج الخلوية المحتملة (EEAs) في موقع تسخين البراري وإثراء ثاني أكسيد الكربون في قطع الأراضي الضابطة وقطع الأراضي الخاضعة للمعاملة. في هذا المثال، لم تختلف مقايسات أنشطة اكتساب إنزيمات الكربون والنيتروجين والفوسفور المحتملة عند أعماق التربة من 0 إلى 5 سم باختلاف المعاملة التجريبية.

ومع ذلك، عند أعماق تربة تتراوح بين 5 إلى 15 cm، تباينت عدة أنزيمات خارج خلوية (EEAs) محتملة بشكل ملحوظ. فعلى سبيل المثال، كانت أنزيمات تفكيك الكربون beta one four glucoside و beta D cello biolace أقل في قطع الأراضي الخاضعة لمعاملة رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون والتدفئة مقارنة بقطع الأراضي ذات الظروف المناخية المحيطة، كما كانت أنزيمات تمعدن النيتروجين والفوسفور أقل أيضاً في قطعة أرض المعاملة مقارنة بالظروف المناخية المحيطة، وذلك عند أعماق تربة تتراوح بين 5 إلى 15 cm.

يمكن أن يكون حساب ورسم مجموع كافة أنشطة الإنزيمات خارج الخلوية (EEAs) الكامنة لدورات الكربون أو النيتروجين أو الفسفور نهجاً مفيداً لملاحظة الأنماط الأوسع المتعلقة بدورات الكربون والنيتروجين و/أو الفسفور المحتملة في التربة. في هذا المثال، تم حساب مجموع أنشطة $\beta$-1,4-glucuco و$\beta$-D-cello وbio hydrolase و$\beta$-xlo و$\alpha$-1,4-glucco الكامنة لتمثيل أنشطة دورة الكربون المحتملة. كما تم حساب مجموع $\beta$-1,4-N-acetylglucose amid dase وL-leucine amino peptidase لتمثيل أنشطة دورة النيتروجين المحتملة.

استُخدم الفوسفاتاز لتمثيل أنشطة دورة الفوسفور المحتملة. وقد اتجهت أنشطة الإنزيمات خارج الخلوية (EEAs) المحتملة لدورات الكربون والنيتروجين والفوسفور الكلية نحو الانخفاض في قطع تجارب زيادة ثاني أكسيد الكربون والتسخين مقارنة بقطع تجارب الظروف المناخية المحيطة عند أعماق تربة تتراوح بين 5 إلى 15 سنتيمتراً. ومع ذلك، كان هذا الاتجاه معنوياً فقط لأنشطة دورات النيتروجين والفوسفور الكلية، ولم تختلف أنشطة الإنزيمات خارج الخلوية في التربة بشكل معنوي بين قطع التجارب.

عند أعماق تربة تتراوح من 0 إلى 5 سنتيمتر. تشير النتائج إلى اتجاهات متباينة في نشاط الإنزيمات والمجموعات الوظيفية بين قطع الأراضي المعالجة استجابةً لعمق التربة، وتعد نسبة أنشطة الإنزيمات خارج الخلية (EEAs) المحتملة إحدى طرق تقييم الاحتياجات الغذائية الميكروبية. وهنا، تختلف أنشطة إنزيمات التربة، وهندسة التوكي (tochi geometry)، ونسبة الكربون إلى النيتروجين، أو الكربون إلى الفوسفور، أو النيتروجين إلى الفوسفور بشكل ملحوظ بين قطع الأراضي المعالجة عند أعماق تربة تتراوح من 0 إلى 5 سنتيمتر.

ومع ذلك، كانت النسب المحتملة للكربون إلى الفسفور والنيتروجين إلى الفسفور في الإنزيمات أعلى في قطع التجارب التي تعرضت لارتفاع ثاني أكسيد الكربون والتسخين. ومقارنة بظروف المناخ المحيطة عند أعماق التربة من 5 إلى 15 سنتيمتر، يمكن أن تؤثر درجة الحرارة بقوة على الإنزيمات خارج الخلوية في التربة (EEAs). ومع ذلك، في المقايسات المختبرية النموذجية، يتم قياس إنزيمات التربة عند درجة حرارة واحدة قد لا تتوافق مع ظروف درجة الحرارة في حالة ارتفاع ثاني أكسيد الكربون.

تُستخدم مخططات أرينيوس لتصور طاقة التنشيط، ويتم رسمها باستخدام لوغاريتم نشاط الإنزيم كدالة لمقلوب درجة الحرارة المحولة إلى درجات كلفن على المحور السيني. تُعرف طاقة التنشيط عادةً بأنها الحد الأدنى من الطاقة المطلوبة لتحفيز التفاعل الكيميائي، وتُستخدم هنا كمؤشر للحساسية الحرارية للتفاعلات التي يحفزها الإنزيم. وتشير طاقة التنشيط الأعلى إلى زيادة حساسية الإنزيم تجاه درجة الحرارة.

وبالمثل، تتناسب طاقات التنشيط مباشرة مع Q 10. تم تقييم قيم معامل درجة الحرارة لحركية الإنزيمات المحتملة لعمليات التمثيل الإنزيمي (EEAs) للكربون والنيتروجين والفوسفور في كلا قطاعي المعالجة عند عمقي التربة، وأظهرت النتائج أن الحساسية لدرجة الحرارة في عمليات التمثيل الإنزيمي لم تكن مختلفة بشكل معنوي بين قطاعات المعالجة عند أي من عمقي التربة. وبمجرد إتقان الطريقة، يمكن تلقيح 12 عينة في ألواح المعايرة الدقيقة ذات 96 بئراً في غضون 30 دقيقة أو أقل.

علاوة على ذلك، بعد فترات التحضين المحددة، يمكنك عادةً إجراء عملية الطرد المركزي ونقل الأطباق وقراءتها مرة أخرى على جهاز قياس البول (urometer) في غضون نصف ساعة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام الماصة بدقة واتساق؛ حيث إن وجود أي فقاعات هواء أثناء عملية السحب سيؤثر سلبًا على نتائجك عند اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل استخلاص الحمض النووي DNA وتسلسله للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بدور تكوين المجتمع الميكروبي في التربة في وظيفة التربة بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيئة الميكروبية لاستكشاف دورة المغذيات والعمليات الكيميائية الجيولوجية الحيوية في النظم البيئية البرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد جداً حول كيفية قياس أنشطة الإنزيمات المحتملة.

علاوة على ذلك، يجب أن تكون قادراً على تفسير البيانات لتعكس الاستجابات الميكروبية المحتملة لعوامل مثل المناخ وأنواع التربة المختلفة ضمن النظم البيئية المختلفة. ولا تنسَ أنه عند العمل مع المواد الفلورية، يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتقليل التعرض للضوء بسبب حساسية الجزء الفلوري للضوء.