Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف التغييرات التأكيدية المرتبطة بارتباط الترابط بمحولات الكالسيوم على المقياس الزمني دون المللي ثانية. يحدث الانتقال التأكيدي بين بروتين APO إلى البروتين المرتبط بالكالسيوم عن طريق الانقسام الضوئي لمركب الكالسيوم DM نيترو الكالسيوم المحبوس والذي يؤدي إلى إطلاق صور الكالسيوم الحر. يتم قياس التغيير المرتبط في مؤشر الانعكاس على أنه إزاحة لحزمة المسبار باستخدام كاشف حساس للموضع الرباعي.

بعد ذلك ، يتم قياس آثار انحراف الشعاع الحراري الضوئي كدالة لدرجة الحرارة لكل من العينة والمرجع. يوفر التحليل المركب لآثار انحراف شعاع الصورة نظرة ثاقبة لآلية التبديل التأكيدي الناجم عن الكالسيوم من حيث حجم التفاعل وتغيرات المحتوى الحراري. الميزة الرئيسية لانحراف الحزمة الحرارية الضوئية على الصاري الحالي ، مثل التدفق العلوي ، هي أن هذه التقنيات تسمح بالكشف المتزامن عن تغيرات الحجم والإنتروبيا على مقياس زمني أقل من المللي ثانية.

العرض المرئي لهذه التقنية ضروريا لأن المحاذاة الدقيقة للأداة أمر بالغ الأهمية لاستعادة المعلمات الديناميكية الحرارية. وسيتم توضيح الإجراء والتر غونزاليس ، طالب دراسات عليا من مختبري ، وإجراء إعداد العينة وجميع عمليات التلاعب بالعينات في غرفة مظلمة لمنع أي فك غير مرغوب فيه. في هذا الفيديو ، يتم توضيح الخطوات في الضوء لأغراض التصوير.

للبدء في إذابة DM Nitro في أكوام 50 ملليمولار ، قم بتخزين مؤقت 100 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 7.0 إلى تركيز نهائي يبلغ 400 ميكرومولار. أضف كلوريد الكالسيوم من محلول المخزون 0.1 مولار لتحقيق نسبة تركيز الكالسيوم إلى نيترو DN المرغوبة. بعد ذلك ، قم بإذابة المركب المرجعي سيانيد البوتاسيوم أو كرومات الصوديوم في نفس المخزن المؤقت.

بالنسبة للعينة ، راجع بروتوكول النص للحصول على تخطيطي للتكوين التجريبي الأساسي لانحراف الحزمة الحرارية الضوئية. عند إعداد التجربة ، قم بنشر شعاع الاحتياجك من خلال مركز الخلية ، ووضعه في حامل خلية يتم التحكم في درجة حرارته. ثم باستخدام ثقب ، اضبط قطر شعاع المسبار على ملليمتر واحد ، واستخدم مرآة ثانية خلف العينة لتوسيط شعاع الاحتياجك في مركز الكاشف الحساس للموضع.

ركز الحزمة الاحترافية على مركز الكاشف بحيث يكون الفرق في الجهد بين الثنائيين العلويين والثنائيين السفليين ، بالإضافة إلى الفرق في الجهد بين الصمامين الثنائيين على الجانب الأيسر والأيمن من الكاشف صفرا. بعد ذلك قم بتشكيل قطر شعاع المضخة ، وهو إخراج 355 نانومتر من ليزر ND YAG. باستخدام ثقب ثلاثي الملم ، يتم وضعه بين 2 355 نانومتر ، تنشر شعاع المضخة عبر مركز المضخة الصغيرة.

من المهم أن يتم نشر كل من حزمتي الليزر من خلال مركز الخلية الضوئية بطريقة كولينية تقريبا. للحصول على زاوية انحراف قابلة للقياس وبالتالي السعة العالية لانحراف الحزمة الحرارية الضوئية أو إشارة PBD ، استخدم مركبا مرجعيا لمحاذاة المسبار وحزمة المضخة لتحقيق إشارة PBD مرضية تتميز بنسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء وسعة PBD مستقرة على نطاقات زمنية أطول. ثم ضع شعاع المضخة فيما يتعلق بشعاع المسبار عن طريق الضبط التدريجي لمرايا الليزر 355 نانومتر.

قم بقياس سعة الإشارة المرجعية PBD كفرق بين صمامين ثنائيين للصور العلوية والسفلية على الكاشف الحساس للموضع. وينبغي أن تظهر إشارة PBD زيادة سريعة في الاتساع على نطاق زمني سريع وأن تظل مستقرة على المقياس الزمني البالغ 100 مللي ثانية. تحقق من الخطية في سعة إشارة PBD فيما يتعلق بالطاقة الحرارية المنبعثة عن طريق قياس الاعتماد الخطي لإشارة PBD على طاقة ليزر الإثارة ، وعلى عدد أينشتاين الممتص.

حافظ على طاقة الليزر أقل من 1000 جول ميكرو لمنع امتصاص الفوتون المتعدد. أيضا ، حافظ على امتصاص العينة أو المركب المرجعي عند طول موجة إثارة أقل من 0.5 لمنع انخفاض طاقة شعاع المضخة. وستكفل هذه الخطوات خطية إشارة PBD.

ابدأ بقياس آثار PBD. كمرجع ، ضع محلول المركب المرجعي في خلية كوارتز وضع الخلية في الحامل الذي يتم التحكم في درجة حرارته. كشف إشارة PBD المرجعية كدالة لدرجة الحرارة في نطاق درجة الحرارة من 16 إلى 35 درجة مئوية مع زيادة درجة الحرارة بمقدار ثلاث درجات مئوية.

عند كل تغيير في درجة الحرارة. تحقق من موضع شعاع الاحتياج على الكاشف الحساس للموضع وأعد ضبط الموضع في مركز الكاشف. إذا لزم الأمر، تحقق من خطية إشارة PBD كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم ضع محلول العينة في نفس الخلية الضوئية المستخدمة للمركب المرجعي مع الحفاظ على نفس اتجاه الخلية الضوئية للقياس المرجعي. تابع لاكتشاف آثار PBD العينة في نفس نطاق درجة الحرارة كما هو الحال بالنسبة للمرجع ، وتحقق من خطية سعة PBD العينة. خذ سعة إشارة PBD المرجعية كفرق بين الزناد الجميل وإشارة PBD بعد الزناد.

مماثلة ، حدد اتساع المرحلة السريعة والبطيئة لعينة إشارة PBD. للتخلص من معلمة استجابة الجهاز ، قم بقياس سعة عينة إشارة PBD بسعة إشارة PBD. كمرجع ، تعطي نسبة إشارة العينة إلى الإشارة المرجعية معادلة يمكن من خلالها تحديد إطلاق الحرارة إلى المحلول وتغير الحجم غير الحراري المرتبط بتفاعل يبدأ الصورة من المنحدر واعتراض مخطط نسبة السعة مضروبا في الطاقة مقابل المصطلح المعتمد على درجة الحرارة لتحديد حجم التفاعل وتغير المحتوى الحراري لمقياس العملية السريع والبطيء ، يتغير الحجم المرصود والمحتوى الحراري إلى العائد الكمي المناسب.

وفقا للمعادلات الموجودة في بروتوكول النص ، يتم تحليل السعات والأعمار للخطوات الفردية عن طريق ملاءمة البيانات للوظيفة المعتمدة على الوقت التي تصف تغيرات الحجم والمحتوى الحراري. يقابل اتساع الخطوة السريعة اتساع المرحلة السريعة لإشارة PBD العينة ويقابل اتساع الخطوة اللاحقة اتساع الطور البطيء لإشارة PBD العينة. لكل عملية فردية من الاعتماد على درجة الحرارة لثابت المعدل للعمليات الفردية ، يمكن تحديد معلمات المحتوى الحراري والانتروبيا للتنشيط بسهولة باستخدام مخططات الأشعة تحت الحمراء.

هنا مثال تمثيلي لآثار PBD لإطلاق صور الكالسيوم من نيترو DM الكالسيوم. تتوافق المرحلة السريعة مع الانقسام الضوئي لنيترو الكالسيوم DM وتحرير الكالسيوم ، بينما تعكس المرحلة البطيئة ارتباط الكالسيوم بالقفص غير المصور. يظهر هنا تتبع PBD لارتباط الكالسيوم بالمجال الطرفي C لمستشعر الكالسيوم العصبي المضاد أو المنظم أو الحلم عند تفكك صور الكالسيوم.

يرتبط الترابط الذي تم إصداره بالمجال الطرفي C للحلم بثابت زمني 1.3 زائد أو ناقص 0.3 مللي ثانية عند 20 درجة مئوية من الاعتماد على درجة الحرارة لثابت المعدل المرصود. تم تحديد حاجز التنشيط لارتباط الكالسيوم بالمجال الطرفي C للحلم ليكون 9.2 زائد أو ناقص 0.4 كيلو سعرة حرارية لكل مول. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر قياس آثار PBD العينة في ظل ظروف مطابقة لتلك الخاصة بالرجوع إليها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد العينة ومحاذاة الأجهزة وتحليل البيانات للحصول على معلمة ديناميكية حرارية قابلة للتكرار.