Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف التغيرات التشكيلية المرتبطة بارتباط الربيطة بمحولات الكالسيوم على مقياس زمني أقل من الميلي ثانية. يتم تحفيز الانتقال التشكيلي من البروتين APO إلى البروتين المرتبط بالكالسيوم عن طريق التحلل الضوئي لمركب كالسيوم مقيد وهو calcium DM nitro، مما يؤدي إلى التحرر الضوئي للكالسيوم الحر. ويتم قياس التغير المصاحب في معامل الانعكاس كإزاحة لشعاع المسبار باستخدام كاشف رباعي حساس للموضع.

بعد ذلك، يتم قياس آثار انحراف الشعاع الضوئي الحراري كدالة في درجة الحرارة لكل من العينة والمرجع. ويوفر التحليل المركب لآثار انحراف الشعاع الضوئي رؤية متعمقة في آلية التبديل التشكلي المستحث بالكالسيوم من حيث تغيرات حجم التفاعل والمحتوى الحراري. وتكمن الميزة الرئيسية لانحراف الشعاع الضوئي الحراري مقارنة بالطرق الحالية، مثل التدفق العلوي، في أن هذه التقنية تسمح بالكشف المتزامن عن تغيرات الحجم والاعتلاج على مقياس زمني أقل من الميلي ثانية.

يعد العرض المرئي لهذه التقنية ضرورياً لأن المحاذاة الدقيقة للجهاز أمر بالغ الأهمية لاستعادة المعلمات الديناميكية الحرارية. سيقوم والتر غونزاليس، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، بشرح الإجراء. يجب إجراء تحضير العينة وجميع عمليات مناولة العينات في غرفة مظلمة لمنع أي تحرير غير مرغوب فيه للمجموعات (uncaging). في هذا الفيديو، يتم عرض الخطوات في الضوء لأغراض التصوير.

للبدء، قم بإذابة DM Nitro في محلول منظم HEPES بتركيز 50 millimolar وكلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar، وعند pH 7.0 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 400 micromolar. أضف كلوريد الكالسيوم من المحلول المخزون بتركيز 0.1 molar لتحقيق نسبة تركيز الكالسيوم إلى DN nitro المطلوبة. بعد ذلك، قم بإذابة المركب المرجعي سيانيد البوتاسيوم أو كرومات الصوديوم في المحلول المنظم نفسه.

أما بالنسبة للعينة، فيرجى الرجوع إلى البروتوكول النصي للاطلاع على مخطط التكوين التجريبي الأساسي لانحراف الحزمة الضوئية الحرارية. عند إعداد التجربة، يتم تمرير حزمة المسبار عبر مركز خلية موضوعة في حامل خلايا يتم التحكم في درجة حرارته. بعد ذلك، وباستخدام ثقب صغير (pinhole)، يتم ضبط قطر حزمة المسبار ليكون 1 mm، ثم تُستخدم مرآة ثانية خلف العينة لتوسيط حزمة المسبار في مركز الكاشف الحساس للموضع.

قم بتركيز حزمة المجس (pro beam) على مركز الكاشف بحيث يكون الفرق في الجهد بين الثنائيين العلويين والثنائيين السفليين، وكذلك الفرق في الجهد بين الثنائيين الموجودين على الجانبين الأيسر والأيمن من الكاشف، مساوياً للصفر. بعد ذلك، قم بتشكيل قطر حزمة الضخ (pump beam)، وهي مخرج بطول موجي 355 nanometer من ليزر ND YAG. وباستخدام ثقب دقيق (pinhole) بقطر 3 millimeter يوضع بين مرآتين لليزر 355 nanometer، قم بتوجيه حزمة الضخ لتنتشر بشكل متوازي عبر مركز الـ vete.

من المهم أن ينتشر كلا شعاعي الليزر عبر مركز الخلية البصرية بشكل متوازي تقريباً. وللحصول على زاوية انحراف قابلة للقياس، وبالتالي سعة عالية لإشارة انحراف الشعاع الضوئي الحراري أو إشارة PBD، استخدم مركباً مرجعياً لمحاذاة شعاع المسبار والشعاع الضخ لضمان الحصول على إشارة PBD مرضية تتميز بنسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة وسعة PBD مستقرة على الفترات الزمنية الطويلة. بعد ذلك، قم بتحديد موضع الشعاع الضخ بالنسبة لشعاع المسبار من خلال الضبط التدريجي لمرايا ليزر 355 nanometer.

قم بقياس سعة إشارة PBD المرجعية كفرق بين صمامين ثنائيين ضوئيين علوي وسفلي في الكاشف الحساس للموضع. يجب أن تظهر إشارة PBD زيادة سريعة في السعة على مقياس زمني سريع، وأن تظل مستقرة على مقياس زمني قدره 100 millisecond. تحقق من خطية سعة إشارة PBD فيما يتعلق بالطاقة الحرارية المنطلقة عن طريق قياس الاعتماد الخطي لإشارة PBD على قدرة ليزر الإثارة، وعلى عدد فوتونات آينشتاين الممتصة.

حافظ على قدرة الليزر دون 1000 micro joules تقريباً لمنع الامتصاص متعدد الفوتونات. كما يجب الحفاظ على امتصاصية العينة أو المركب المرجعي عند طول موجة الإثارة بأقل من 0.5 لمنع انخفاض قدرة حزمة الضخ. ستضمن هذه الخطوات خطية إشارة PBD.

ابدأ بقياس آثار PBD. بالنسبة للمرجع، ضع محلول المركب المرجعي في خلية كوارتز وثبت الخلية في حامل متحكم في درجة حرارته. قم بالكشف عن إشارة PBD المرجعية كدالة في درجة الحرارة في نطاق يتراوح من 16 إلى 35 درجة Celsius بزيادة قدرها ثلاث درجات Celsius في درجة الحرارة.

عند كل تغيير في درجة الحرارة، تحقق من موضع شعاع المسبار على الكاشف الحساس للموضع، وأعد ضبط الموضع ليكون في مركز الكاشف. وإذا لزم الأمر، تحقق من خطية إشارة PBD كما هو موضح في البروتوكول النصي.

بعد ذلك، ضع محلول العينة في نفس الخلية الضوئية المستخدمة للمركب المرجعي مع الحفاظ على نفس اتجاه الخلية الضوئية المستخدم في القياس المرجعي. ابدأ في الكشف عن آثار PBD للعينة في نفس نطاق درجة الحرارة المستخدم للمرجع، وتحقق من خطية سعة PBD للعينة. احسب سعة إشارة PBD المرجعية باعتبارها الفرق بين إشارة PBD قبل القدح (pre-trigger) وإشارة PBD بعد القدح (post-trigger).

وبطريقة مماثلة، قم بتحديد سعة الطور السريع والبطيء لإشارة PBD الخاصة بالعينة. ولإلغاء معامل استجابة الجهاز، قم بقياس سعة إشارة PBD للعينة بالنسبة لسعة إشارة PBD المرجعية. وبالنسبة للمرجع، فإن نسبة إشارة العينة إلى الإشارة المرجعية تعطي معادلة يمكن من خلالها تحديد الحرارة المنطلقة إلى المحلول والتغير الحجمي غير الحراري المرتبط بتفاعل يبدأ ضوئياً، وذلك من خلال الميل والتقاطع في مخطط نسبة السعة مضروبة في الطاقة مقابل الحد المعتمد على درجة الحرارة؛ ولتحديد حجم التفاعل وتغير المحتوى الحراري للعمليتين السريعة والبطيئة، قم بقياس الحجم الملحوظ وتغير المحتوى الحراري بالنسبة للمردود الكمي المناسب.

وفقاً للمعادلات الواردة في البروتوكول النصي، يتم تحليل السعات وأعمار النصف للخطوات الفردية عن طريق مطابقة البيانات بالدالة المعتمدة على الوقت التي تصف التغيرات في الحجم والمحتوى الحراري. وتتوافق سعة الخطوة السريعة مع سعة المرحلة الفورية لإشارة PBD للعينة، بينما تتوافق سعة الخطوة اللاحقة مع سعة المرحلة البطيئة لإشارة PBD للعينة. وبالنسبة لكل عملية فردية، يمكن تحديد معلمات محتوى التنشيط الحراري والاعتلاج بسهولة باستخدام مخططات IR من خلال الاعتماد الحراري لثابت المعدل للعمليات الفردية.

يظهر هنا مثال تمثيلي لآثار PBD للتحرير الضوئي للكالسيوم من calcium DM nitro. وتتوافق المرحلة السريعة مع الانشطار الضوئي لـ calcium DM nitro وتحرير الكالسيوم، بينما تعكس المرحلة البطيئة ارتباط الكالسيوم بالقفص غير المتأثر بالضوء. كما يظهر هنا أثر PBD لارتباط الكالسيوم بالنطاق الطرفي C لمستشعر الكالسيوم العصبي downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream عند التفكك الضوئي للكالسيوم.

يرتبط اللجين المتحرر ضوئياً بالنطاق الطرفي C لبروتين dream بثابت زمني قدره 1.3 ± 0.3 milliseconds عند درجة حرارة 20 °C، وذلك من خلال دراسة اعتماد ثابت المعدل الملحوظ على درجة الحرارة. وقد تم تحديد حاجز التنشيط لارتباط الكالسيوم بالنطاق الطرفي C لبروتين dream بقيمة 9.2 ± 0.4 kilo calories per mole. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر قياس آثار PBD للعينة في ظروف مطابقة تماماً لتلك المستخدمة في المرجع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينة، ومحاذاة الأجهزة، وتحليل البيانات للحصول على معامل ثيرموديناميكي قابل للتكرار.