تحليل مجسم الفيديو لنقص الأكسجين الرئوي من الشرايين داخل الرئة باستخدام مورين الدقة قطع شرائح الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل التضيق الوعائي الرئوي الناجم عن نقص الأكسجة في الشرايين الرئوية المتقابلة التي تتراوح أقطارها الداخلية بين 20 و 100 ميكرون. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ملء الممرات الهوائية في الرئتين بمادة aros ذات نقطة الانصهار المنخفضة. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام جهاز اهتزاز لتقطيع الرئتين المعزولتين إلى شرائح بسمك 200 ميكرون.

بعد ذلك، تتم إزالة الـ aros من قطاعات الرئة عن طريق التحضين في وسط دافئ عند درجة حرارة 37 degrees Celsius، مع تمرير غاز normoxic فيه، بحيث تتحرك القطاعات ببطء في السائل. ثم يتم نقل قطاع رئة فردي إلى غرفة superfusion ذات تدفق مستمر، يتبع ذلك إجراء تحليل morphometric بالفيديو للتفاعلية الوعائية للشريان المقطوع عرضياً.

في النهاية، يتم تقييم التغيرات في المساحة اللمعية للوعاء الدموي استجابةً للمعالجات المختلفة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر الحيوي للأوعية الدقيقة تحت الجنب، وقياس التوتر الوعائي في الشرايين الرئوية القريبة المعزولة، في أنها تسمح بالتحليل الكمي لاستجابة الشرايين داخل الرئة التي تتراوح أقطارها بين 20 و 100 ميكرومتر. ستقوم آنا جولدنبرج وفنيّان من هذا المختبر باستعراض هذا الإجراء.

بعد قتل الفأر مباشرة عن طريق خلع الفقرات العنقية، افتح التجويف البطني، وحرّك العرى المعوية جانباً ثم اقطع الأوعية الدموية البطنية الكبيرة لإحداث نزيف. بعد ذلك، استخدم مقصاً دقيقاً لاختراق الحجاب الحاجز، مما يؤدي إلى انكماش الرئتين نتيجة دخول الهواء إلى التجويف الجنبي.

استمر في القطع لفصل الحجاب الحاجز عن الفتحة الصدرية السفلية. الآن، اقطع الأضلاع والترقوة من الناحية الوحشية. ولإزالة الجزء البطني من القفص الصدري، قم باستخراج الغدة الزعترية.

املأ محقنة بـمنظم تروية دافئ. بعد ذلك، اصنع ثقباً صغيراً في البطين الأيسر للقلب. اضبط تدفق منظم التروية وقم بتروية الأوعية الدموية الرئوية ببطء عبر البطين الأيمن حتى تظهر الرئتان باللون الأبيض.

بعد ذلك، قم بإزالة الغدد اللعابية والعضلات الصغيرة والأنسجة الضامة من الرغامي. افصل الرغامي عن الأنسجة الضامة المحيطة به وأدخل قطعة من قطن الخياطة بين المريء والرغامي من أجل الربط لاحقاً. ثم استخدم مقصاً دقيقاً لعمل فتحة صغيرة في الجزء العلوي من الرغامي بين غضروفين رغاميين متجاورين.

بعد ملء حقنة بـ agarose منخفض درجة الانصهار، دافئ عند 37 درجة مئوية، قم بتوصيلها بقنية بلاستيكية مرنة وادفع المكبس ببطء حتى يتم تفريغ الهواء من القنية. أدخل القنية في الفتحة الصغيرة الموجودة في الرغامي وثبتها بعناية في مكانها باستخدام قطن الخياطة. بعد ذلك، املأ المسالك الهوائية بـ agarose ببطء وراقب الرئتين.

في البداية، تبدأ الرئة اليمنى في التمدد، تليها الرئة اليسرى. وبعد مرور 30 إلى 40 ثانية، تكتمل عملية الملء وتنتفخ كلتا الرئتين إلى حجم مماثل للحالة في الجسم الحي، والذي يتراوح بين 1.2 إلى 2.0 milliliters تقريباً. وبناءً على الجنس والعمر والوزن، من المهم حقن محلول egg rose بسرعة كافية حتى لا يتصلب بشكل زائد أثناء الإجراء، ولكن ليس بسرعة تؤدي إلى إتلاف الرئتين.

بعد ملء الرئتين في آن واحد، اسحب القنية البلاستيكية واربط القصبة الهوائية بخيط قطني لمنع تسرب الـ aros. بعد ذلك، اقطع القصبة الهوائية فوق الرباط، ولفصل الرئتين والقلب ككتلة واحدة من الصدر، انقل الأعضاء إلى محلول ringer buffer بارد جداً (مثلج) لتجميد الـ agros، وهو ما يحدث خلال بضع دقائق أثناء الانتظار. استخدم الغراء الفائق (super glue) لتثبيت قطعة من سدادة الشمبانيا في حامل العينات الخاص بالهزاز لتعمل كدعامة لأنسجة الرئة. بعد أن يتجمد الـ agros، قم بفصل فصوص الرئة الفردية.

بعد ذلك، استخدم الغراء الفائق (super glue) لتثبيت فص واحد على حامل العينات. وللحصول على مقاطع عرضية للشرايين داخل الفص الصغيرة، خذ الفص القحفي من الرئة اليمنى وثبته بالغراء الفائق بحيث يكون سطح السرة (hilum) مواجهاً للحامل، وباستخدام جهاز تقطيع اهتزازي (vibratome) مزود بشفرة حلاقة جديدة، يتم التقطيع من المحيط لتقسيم فص الرئة إلى شرائح بسمك 200 micron. وللحصول على مقاطع عرضية للشرايين قبل الفص الأكبر، قم بمحاذاة سرة الرئة اليسرى مع سدادة الشمبانيا وثبّت الفص بهذا الوضع على الحامل، ثم يتم التقطيع من المحيط لإزالة الأطراف.

انقل قطاعات الأعضاء إلى دورق زجاجي مملوء بنحو 200 milliliters من وسط MEM عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. ضع الدورق في خزانة تسخين وقم بعملية التفقيع باستخدام غاز normoxic بحيث تتحرك قطاعات الرئة ببطء في الوسط. بعد مرور نحو ساعتين، ستكون لويحات الأروس التي تملأ الهواء قد أزيلت من أنسجة الرئة، وستكون القطاعات قد استقرت في قاع الدورق.

لإجراء التحليل المورفومتري بالفيديو للشرايين الرئوية الداخلية، انقل مقطعاً واحداً من الرئة إلى غرفة الإرواء المستمر، المثبتة على المجهر والمليئة بـ 1.2 milliliters من MEM المشبع بالغازات في ظروف الأكسجين الطبيعية. قم بتثبيت مقطع الرئة في قاع الغرفة باستخدام خيوط نايلون متصلة بحلقة من البلاتين. ابدأ بعملية إرواء الغرفة بالوسط المشبع بالغازات في ظروف الأكسجين الطبيعية.

استخدم مجهراً بتباين الطور مع عدسة شيئية بقوة 10x لمسح مقطع الرئة بحثاً عن شرايين مقطوعة عرضياً يتراوح قطرها الداخلي بين 20 و100 ميكرون. بمجرد تحديد وعاء دموي مرشح ومناسب، استخدم العدسة الشيئية بقوة 20x لالتقاط صورة لوعاء ما قبل تضيق الشريان، أو كما هو موضح هنا، استخدم العدسة الشيئية بقوة 40x لالتقاط صورة لشريان داخل التضيق لقياس القطر الداخلي للوعاء. قبل البدء في التجربة، قم بضبط البرنامج لالتقاط صور للشريان المقطوع عرضياً كل دقيقة طوال فترة التجربة.

بعد بدء التصوير، استمر في تروية الحجرة بوسط gast normoxic لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، اغمر مقطع الرئة في U 466 19 لمدة 10 دقائق بدون تدفق لتحليل انقباض الشريان، مع استخدام الأوعية التي انخفضت مساحات تجويفها بنسبة 30% على الأقل بفعل U 466 19. اغسل الدواء باستخدام وسط gast normoxic لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بتوسيع الشريان عن طريق تطبيق res لمدة 10 دقائق دون تدفق منخفض. ثم قم بإزالة الدواء عن طريق الغسل لمدة 10 دقائق باستخدام وسط غازي normoxic بمعدل تدفق يبلغ 6 milliliters per minute، يليه 10 دقائق بتدفق قدره 0.7 milliliters per minute. بعد ذلك، قم بحضن شريحة الرئة في وسط غازي hypoxic عالي لمدة 40 دقيقة.

قم أيضاً بتمرير خليط الغاز ناقص الأكسجة إلى الفراغ الهوائي في غرفة التروية عبر مجموعة إضافية من الأنابيب. قم بإزالة الوسط ناقص الأكسجة عن طريق الغسل لمدة 20 دقيقة بوسط غازي طبيعي الأكسجة، وحوّل تدفق الغاز في الفراغ الهوائي للغرفة من ناقص الأكسجة إلى طبيعي الأكسجة للتحقق من حيوية الوعاء الدموي. في نهاية التجربة، أضف U 466 19 إلى غرفة التروية واتركه في الحاضنة لمدة 20 دقيقة بدون تدفق لتحفيز تضيق الأوعية.

كرر هذه الخطوات باستخدام مقطع رئوي جديد لقياس التفاعلية الوعائية لوعاء دموي آخر. ابدأ التحليل بتحميل صور المقاطع العرضية للشرايين في برنامج لتحليل الصور، ثم استخدم المؤشر لتحديد مساحة التجويف الداخلي للوعاء.

يعتبر تجفيف اليدين ضرورياً لتجنب ظهور الشوائب الاصطناعية الناتجة، على سبيل المثال، عن التصاق خلايا الدم بالجدار الوعائي. استمر في تحليل الصور المقطعية بطريقة مماثلة. يجب تحليل كل صورة عند تغيير حالة واحدة في غرفة التحضين ذات التدفق إلى حالة أخرى، بينما يكفي تحليل صورة واحدة من كل صورتين عندما لا تتغير الظروف.

يمكن ملاحظة تضيق الأوعية الرئوية الناجم عن نقص الأكسجة في صور تباين الطور هذه لمقطع عرضي في شريان pre ASIN، والذي يمتد على مقربة من قصيبة شعبية مقطوعة عرضياً. تم التقاط الصور في النقاط الزمنية المحددة بدوائر في الرسم البياني: عند بداية القياس، وعند نهاية القياس باستخدام U 466 19، وعند نهاية التعرض لـ RAs، وبعد 30 أو 40 دقيقة في وسط غازي ناقص الأكسجة، وبعد الغسل بوسط غازي طبيعي الأكسجة، وبعد التطبيق النهائي لـ U 466 19. يتم تسجيل التفاعل الوعائي كتغيرات نسبية في مساحة تجويف الشريان المقطوع عرضياً مقابل الوقت. تُحدد المساحة في بداية التجربة بنسبة 100%، ويُعبر عن تضيق الأوعية كقيم نسبية مقارنة بالمساحة الأولية.

في هذه الحالة، يؤدي التعرض لنقص الأكسجة إلى تقليل المساحة اللمعية بنسبة 60% من أجل تقديم أوضح للاستجابة لنقص الأكسجة. لم يتم عرض المرحلة الأولية من التجربة التي تم فيها اختبار التفاعلية الوعائية هنا، وقد تم تعيين القيمة التي تم الحصول عليها مباشرة قبل التعرض للأكسجين المخفض عند 100%. أما النوع الآخر من الأوعية التي تم فحصها في هذه الدراسات فهي الشرايين الموجودة داخل ASIN، والتي تقع عند ثنيات الحواجز السنخية. وفي هذه المجموعة من التجارب، يتم تحليل تأثير sidal، وهو فاتح غير انتقائي لقنوات البوتاسيوم الحساسة لـ ATP الميتوكوندرية، على تضيق الأوعية الرئوية الناتج عن نقص الأكسجة في الشرايين الصغيرة داخل asner لهذا الغرض.

تُحضن الشرائح في وسط ناقص الأكسجين. وفي غياب أو وجود 50 micromolar من sidal، تُجرى حضنات ضابطة في وسط gast سوي الأكسجين لتقديم عرض أوضح للاستجابة لحالة سوي الأكسجين أو نقص الأكسجين، أو نقص الأكسجين مع sidal. تُحدد القيم التي تم الحصول عليها مباشرة قبل التعرض لوسط gast سوي الأكسجين أو ناقص الأكسجين بنسبة 100%. ولا يظهر الشريان المعرض لـ pineal انخفاضاً في المساحة، على عكس الشريان المحضن في وسط ناقص الأكسجين بدون إضافات.

في الوسط الطبيعي الأكسجين، لا يمكن اكتشاف أي تغيرات في المنطقة اللمعية. تم عرض تسجيلات الشرايين الصغيرة داخل ASIN المعرضة لوسط معوي ناقص الأكسجين مع أو بدون 50 micromolar sidal كمتوسطات زائد أو ناقص SEM. وفي هذا الرسم البياني، تظهر البيانات النسبية مقارنة بالقيمة في بداية الحضن ناقص الأكسجين.

لا يمكن اكتشاف أي تفاعل وعائي. في شرائح الرئة التي تعرضت لغاز نقص الأكسجة، لا يتأثر تضيق الأوعية الصنوبرية الناجم عن U 466 19 في الوسط بالدواء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير دقة المرآة، وقطع شرائح الرئة، وكيفية استخدامها للقياس الكمي للتفاعل الوعائي للشرايين داخل الأسنا الصغيرة التي تتراوح أقطارها بين 20 و 40 micrometers، والتي تقع عند قاعدة الحواجز السنخية، والشرايين قبل الأسنا الأكبر التي تتراوح أقطارها بين 40 و 100 micrometers، والتي تمتد بجوار الشعب الهوائية والشعيبات الهوائية.