طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

الهدف من هذا الإجراء هو تحليل الإكسوسومات حسب حجمها وتحديدها باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية أو أداة NTA من خلال طريقة شبه آلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام خطوات التمركز التفاضلي للحصول على حبيبات الإكسوسوم من دم الإنسان. يتم إعادة تعليق الإكسوسومات بتركيز محدد مسبقا لكمية بدء البلازما للحصول على شدة التشتت المناسبة.

أثناء NTA ، يتم بعد ذلك ترشيح التعليق لفصل الإكسوسومات عن الجسيمات الأكبر. بعد ذلك ، يتم إجراء معايرة لأداة NTA باستخدام تعليق تحكم يحتوي على جزيئات البوليسترين بحجم 200 نانومتر. ثم يتم حقن محلول الإكسوسوم في أداة NTA ويتم تحديد الإعداد المثالي ل NTA عن طريق إجراء اختبار مسبق قبل إجراء الاختبار النهائي.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح القياس الكمي لجميع الجسيمات المقاسة وإدراج الجسيمات حسب أحجامها. يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يجب إجراء الحل والإعداد لكل محلول إكسوسوم محضر بشكل فردي للحصول على أفضل النتائج. يجب أن تكون الإكسوسومات المقاسة بتركيز I بحيث يعرض وضع العرض المباشر حوالي 600 جسيم لكل شاشة.

أيضا ، يجب إجراء اختبار مسبق للعثور على نطاق الحساسية الأمثل للقياس. يؤدي الإعداد العالي للحساسية إلى تصور المزيد من الجسيمات الصغيرة ، كما أنه يزيد من المشكلات المتعلقة بضوضاء الخلفية. سيتم توضيح الإجراء من قبل أنتو ماي ، طالب دراسات عليا من مختبرنا لبدء تحضير الإكسوسوم ، اجمع الدم الكامل في ثلاثة أنابيب سترات عن طريق بزل الوريد ليصبح المجموع تسعة ملليلترات.

ثم صب الدم في جهاز طرد مركزي لأنبوب فالكون سعة 15 مليلتر ، والعينة عند 1 ، 500 جم لمدة 20 دقيقة من أربع درجات مئوية لبدء فصل الخلايا عن البلازما. انقل S الوليدة إلى أنبوب فالكون جديد سعة 15 مل. ثم قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 2 ، 800 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة جميع الخلايا من البلازما.

انقل البلازما الخالية من الخلايا أو CFP إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق بمعدل واحد مليلتر لكل أنبوب. بعد ذلك ، قم بعمل جهاز طرد مركزي CFP عند 100 ، 000 جم لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية لاستنفاد الإكسوسومات. قم بإزالة 900 ميكرولتر من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الفائق.

بعد إضافة 900 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي PBS ، تكتسب 100،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. كما كان من قبل ، قم بإزالة 900 ميكرولتر من عامل الاستلقاء وأعد تعليق الكريات مع 100 ميكرولتر المتبقية. انقل خمسة إلى 20 ميكرولترا من معلق Resus إلى 40 مل من الماء المقطر.

قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 450 نانومتر لفصل الإكسوسومات عن الجسيمات الكبيرة. استخدم هذا التعليق النهائي لقياس الجسيمات لاستخدام أداة تتبع الجسيمات. أولا ، ابدأ البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة البرنامج.

انقر فوق علامات تبويب البرامج المختلفة للتبديل بينها في جميع أنحاء البروتوكول. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة. للتنفيذ التلقائي لإجراء بدء التشغيل، حدد المربعات لكل من التحقق من جودة الخلية والمحاذاة التلقائية.

يمكن تكرار أي من هاتين الخطوتين بشكل منفصل إذا لزم الأمر عن طريق الضغط على الزر A أو B في علامة تبويب فحص الخلية. ضع دقابا أسفل منفذ Outlook لجمع محلول النفايات ولا تحقن فقاعات الهواء في النظام. افتح منفذ المدخل والتوقعات لتحليل تتبع الجسيمات النانوية أو أداة NTA وحقن 10 مل من الماء المقطر عن طريق المحقنة في قناة الخلية من خلال منفذ المدخل.

أغلق منفذ المدخل والمخرج على الفور عند حقن آخر كمية من الماء. تأكد من خلو خلية القياس من فقاعات الهواء. قم بإجراء فحص جودة الخلية بالنقر فوق. حسنًا.

سيعرض البرنامج نتيجة جودة الخلية بعد بضع ثوان ، إذا كانت أي جزيئات لا تزال مرئية في شاشة العرض المباشر للبرنامج ، أو إذا كانت نتيجة فحص الجودة جيدة أو سيئة فقط ، كرر حقن الماء البعيد حتى تتم إزالة الجسيمات المتبقية من خلية القياس L. أيضا ، كرر هذه الخطوة بعد كل قياس لتجنب تراكم الجسيمات. بعد ذلك ، قم بإعداد تعليق تحكم يحتوي على جزيئات بوليسترين موحدة بحجم 200 نانومتر. لمحاذاة بؤر الليزر والمجهر ، أضف قطرة واحدة من تركيز التعليق الذي توفره الشركة المصنعة للجهاز إلى 500 مل من الماء المقطر مما يؤدي إلى التركيز المطلوب بحيث يتم عرض 600 جسيم زائد أو ناقص 100 لكل شاشة في المنظر المباشر.

حقن تعليق المحاذاة في أداة NTA كما هو الحال مع مكبس الماء المقطر. حسنا ، لبدء المحاذاة أيضا ، وهو روتين آلي سيجد النظام من خلاله تلقائيا الموضع الأمثل للبؤرتين. عندما تظهر مطالبة تفيد بأن النظام جاهز الآن للتجارب، انقر فوق موافق لبدء القياس.

أحيانا بتنظيف قناة الخلية يدويا بين التجارب عن طريق شطف الخلية بمحلول 30٪ من الإيثانول. قم بتنظيف القناة عندما يعرض البرنامج تقرير خطأ تلقائي. لإجراء قياس النظام.

أولا ، اغسل القناة بالماء المقطر قبل كل قياس للعينة. ثم حقن تعليق الإكسوسوم في القناة. الخطوة التالية هي ضبط المعلمات الرئيسية في البرنامج لضبط الحساسية.

ابحث عن نطاق الحساسية الأمثل بالنقر فوق عدد الجسيمات مقابل الحساسية لعرض منحنى للجسيمات المقاسة لكل شاشة لمستويات حساسية مختلفة. اختر مستوى حساسية قبل الحد الأقصى لمنحنى المنحنى. يسمح مستوى الحساسية الأعلى بتصور المزيد من الجسيمات الصغيرة ، ولكنه يزيد أيضا من المشكلات المتعلقة بضوضاء الخلفية.

لضبط الحد الأدنى للسطوع ، اختر سطوع بداية يبلغ 20 لقياس الإكسوزوم. لاستخدام هذه الوظيفة كمرشح ، قم بتنظيم هذه المعلمة حتى تفرغ جزيئات تشتت الضوء بقوة. قم بتنظيمه لتضخيم القطع الأثرية المتناثرة الأسبوعية ، والسطوع الشديد حسب الحاجة طوال التجربة.

بعد ذلك ، قم بتعيين مرشح رقمي للتخلص من ضوضاء البكسل والجسيمات المتناثرة غير المرغوب فيها. من خلال تنظيم الحد الأدنى والحد الأقصى للحجم ، استخدم نطاقا من 10 إلى 500 بكسل لقياس الإكسوسوم. اضبط الغالق عن طريق تغيير الفترة الزمنية التي تكون فيها الكاميرا مفتوحة عن طريق ضبط الغالق على 300 ، وهو ما يساوي 3.3 مللي ثانية.

لضبط معلمات القراءة الحية ، قم بالتبديل بين طريقة العرض الرقمية والتناظرية في أي وقت بالنقر فوق زر الصورة الحية. طوال التجربة. راقب شريط شدة التشتت، الذي يعرض حالة تشبع العينة كمؤشر مرمز بالألوان.

لا تحلل الإكسوسومات إذا كان شريط التشتت أحمر. لبدء القياس ، انقر فوق علامة التبويب القياس. اختر الإعدادات في مصفوفة خيارات التشغيل.

قبل كل عملية استحواذ ، حدد فحص الحركة ، واختبار انجراف جسيمات الفحص المتكرر ، وحدد عدد التجارب والتأخير الزمني بينها. قم بإجراء فحص عينة إذا لزم الأمر. أخيرا ، انقر فوق الزر تشغيل الحصول على الفيديو.

في النافذة الجديدة ، حدد عدد الدورات وعدد مواضع القياس. قم بتأكيد الحد الأدنى لمدة الوقت. يتم تتبع الجسيم ليتم احتسابه كجسيم فردي واحد.

من خلال ضبط دقة الفيديو ، تؤدي الدقة المنخفضة إلى مدة تتبع أقصر. أخيرا ، حدد اسم ملف وانقر فوق موافق لبدء القياس. يعرض عدد الجسيمات مقابل منحنى الحساسية الجسيمات في موضع واحد في لحظة واحدة.

أثناء فحص الحساسية التلقائي ، يتم اختيار قيمة حساسية قبل الحد الأقصى لميل الرسم البياني. لا يتم التخلص من القطع الأثرية في تجربة الاختبار هذه ويمكن أن تؤثر على الرسم البياني. يعد تصور الجسيمات على شاشة العرض المباشر مفيدا لتعيين قيمة الحساسية الصحيحة.

تؤدي القيمة المنخفضة جدا إلى اكتشاف عدد قليل من الجسيمات. في حين أن القيمة العالية جدا تظهر صورة رديئة ، تظهر الجسيمات عالية الجودة نقطة واحدة معزولة جيدا عن بعضها البعض في مستوى الحساسية الأمثل. تسمح علامة تبويب النتائج بعد القياس بقراءة المعلمات ، بما في ذلك العدد الإجمالي للجسيمات التي يتم تتبعها ومتوسط عدد الجسيمات لكل موضع وتركيز الجسيمات ، بالإضافة إلى النسبة العددية لحجم الجسيمات إلى النسبة المئوية لأعداد الجسيمات.

يوضح الرسم البياني المحسوب بعد القياس توزيع الجسيمات حسب الحجم. يمكن استخدام الرموز في وضع العرض لتغيير إعدادات الرسم البياني. أيضا ، هناك طرق مختلفة لتحليل الإكسوسومات.

توضح هذه الطريقة طريقة بسيطة للغاية وأنيقة لإجراء تحليل طريقة مماثلة في عملية سريعة لتوليد النتائج في وقت قصير. من أجل مقارنة عينات متعددة ، نوصي بالحفاظ على نفس مستوى التخفيف لجميع العينات. تقبل جميع الإعدادات الحساسية ويمكن تغيير دقة الفيديو بعد ذلك باستخدام مجموعة من برامج التحليل القليلة.

بهذه الطريقة ، يصبح التحليل المقارن للبيانات التي تم الحصول عليها في تجارب مختلفة على كمية وحجم الإكسوسوم متاحا بطريقة شبه آلية.