دليل عملي لPhylogenetics لNonexperts

الهدف العام من هذا المقال هو إعادة بناء شجرة تطور سلالات موثوقة من تسلسلات DNA أو البروتين. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحديد التسلسلات المتشابهة باستخدام برامج blast في NCBI. وتتمثل الخطوة الثانية في محاذاة التسلسلات المتشابهة.

بعد ذلك، يتم تحديد نموذج التطور الأكثر ملاءمة بناءً على المحاذاة. وتتمثل الخطوة النهائية في استنتاج العلاقة التطورية من التسلسلات المحاذاة. وفي النهاية، يُستخدم هذا المسار الإجرائي المتسلسل لتوضيح كيفية انتقال المستخدمين من بيانات التسلسل إلى أشجار تطورية موثوقة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات متنوعة من خلال استنتاج الهوية والوظيفة للتسلسلات الجديدة. لاستخدام النسخة الإلكترونية من أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية أو blast، انتقل إلى المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية أو خادم Blast التابع لـ NCBI. انقر فوق برنامج blast المناسب.

أدخل تسلسلاً نصياً بتنسيق FASTA، مثل التسلسل الموضح هنا، في مربع الاستعلام. انقر فوق برنامج blast المناسب لاستخدامه في البحث، ثم انقر فوق blast. تكون المخرجات بتنسيق HTML افتراضياً، وتعرض التسلسلات الأكثر تشابهاً مع التسلسل النصي المدخل.

يغطي القسم التالي كيفية استخدام ملف blast تنفيذي محلي على نظام Windows Mac. يمكن للمستخدمين الانتقال مباشرةً إلى القسم التالي بعنوان Blast Local executables for Macs x. لتشغيل برنامج blast عبر سطر الأوامر على جهاز يعمل بنظام Windows، قم بتنزيل الملف التنفيذي المناسب لنظام Windows من موقع NCBI blast.

بعد تثبيت برنامج Blast، قم بتكوين متغير بيئة الكمبيوتر الشخصي على النحو التالي: انقر على زر بدء التشغيل في الكمبيوتر الشخصي وانقر بزر الماوس الأيمن على "Computer"، ثم انقر على "Properties". في النافذة الجديدة، اختر "Advanced system settings"، وفي علامة التبويب "Advanced" في النافذة المنبثقة الجديدة، انقر على زر "Environment Variables".

بعد ذلك، ضمن متغيرات المستخدم (user variables) في قسم المستخدم (user section)، انقر فوق الزر "جديد" (new). في النافذة المنبثقة الجديدة، أضف اسم المتغير path، وقيمة المتغير الموضحة هنا. بعد ذلك، قم بتنزيل قاعدة بيانات blast منسقة مسبقاً، والتي يتم تحديثها يومياً من موقع NCBI أو جينوم لكائن حي معين.

بعد ذلك، افتح موجه أوامر MS DOS عن طريق النقر فوق "ابدأ" وكتابة CMD في شريط البحث، ثم انتقل إلى مجلد NCBI blast. أنشئ قاعدة البيانات باستخدام أمر Make blast DB الموضح هنا. أنشئ تسلسلاً بروتينياً للاستعلام باسم test عن طريق إدراج تسلسل نصي بروتيني بتنسيق FASTA في مجلد DB.

بعد ذلك، ولتحديد التسلسلات الأكثر تشابهاً مع البروتين المختبر، قم باستعلام قاعدة البيانات عبر أمر استعلام blast P. يكرر القسم التالي هذه المعلومات لمستخدمي نظام Mac، بينما يمكن لمستخدمي نظام Windows الانتقال مباشرة إلى القسم الخامس الخاص بإنشاء محاذات التسلسلات المتعددة.

لتشغيل برنامج blast عبر سطر الأوامر على جهاز Mac، قم بتنزيل الملف التنفيذي المناسب لنظام MAC من خلال الوصول عن بُعد إلى موقع N-C-B-I-F-T-P. وللقيام بذلك، افتح finder وابحث عن terminal، وفي نافذة terminal، اكتب عنوان FTP الخاص بموقع N-C-B-I-F-T-P. اكتب anonymous لاسم المستخدم وكلمة المرور، ثم اكتب CD blast slash executables slash latest.

قم بسرد الملفات القابلة للتنفيذ عن طريق كتابة LS، ثم قم بتنزيل أحدث إصدار يتوافق مع متطلبات نظامك عن طريق كتابة ما يلي. الآن، قم بفك ضغط الملفات التي تم تنزيلها. أضف الآن موقع الملفات الثنائية لملف blast القابل للتنفيذ إلى المسار (path) الخاص بك حتى تتمكن القشرة (shell) من البحث في هذا الدليل.

عند البحث عن الأوامر، قم بتنزيل قاعدة بيانات blast منسقة مسبقاً أو جينوم من موقع NCBI. ابحث في دليل الجينومات عن طريق كتابة CD genomes. ثم قم بتنزيل الجينوم أو التسلسل المطلوب كما يلي، وبعد ذلك اكتب quit للخروج من موقع FTP.

بعد ذلك، قم بإنشاء قاعدة البيانات عن طريق كتابة تعليمات Make Blast DB. أدخل تسلسلاً استعلامياً بتنسيق FASTA في مجلد bin، ثم استعلم من قاعدة البيانات باستخدام أمر blast P query للعثور على التسلسل الأكثر تشابهاً مع بيانات تسلسل الاختبار؛ ومن بين برامج محاذاة التسلسلات المتعددة (MSA) الشائعة الاستخدام برنامج tea coffee. وبعد إدخال بيانات التسلسل بتنسيق fasta في مربع الاستعلام في موقع tea coffee، يوضح المخرج البقايا المتشابهة من خلال الترميز اللوني.

هناك برنامج آخر شائع الاستخدام لمحاذاة التسلسلات المتعددة (MSA) وهو برنامج clusteral MSA، والذي يمكن تنزيله كإصدار يعمل عبر سطر الأوامر CLUSTERAL W، أو إصدار رسومي CLUSTERAL X لأنظمة تشغيل متنوعة. بعد ذلك، قم بتحميل البيانات إلى برنامج clusteral كنص تسلسلي منسق وسريع عن طريق اختيار علامة تبويب الملف (file tab)، ثم النقر على زر تحميل التسلسلات (load sequences button).

انتقل الآن إلى علامة تبويب المحاذاة (align) وانقر على زر "إجراء محاذاة كاملة" (do complete alignment) لمحاذاة التسلسلات من أجل الحصول على أفضل نموذج تطوري ملائم. قم بتنزيل برنامج protest. بمجرد تنزيل protest، انقر نقرًا مزدوجًا فوق protest.

بمجرد تشغيل برنامج Protest، انقر على "select file" في مربع المحاذاة (alignment box) لتحميل بيانات التسلسل. ثم انقر على "start" لتشغيل البرنامج. وبعد اكتمال التشغيل، يحدد البرنامج أفضل نموذج بناءً على المعايير المستخدمة لاستنتاج التسلسلات.

بعد تنزيل Phi ML وتشغيله، قم بتحميل تسلسل الإدخال كملف تسلسل بصيغة lip عن طريق كتابة اسم الملف وPY. ثم قم بتشغيل البرنامج بكتابة y. وبعد تنزيل برنامج الاستدلال البايزي من موقع Mr Bays، ابدأ تشغيل البرنامج بالنقر فوق الملف التنفيذي. ثم قم بقراءة بيانات التسلسل بصيغة Nexus في البرنامج عن طريق كتابة execute واسم الملف ثم dot NEX.

بعد ذلك، قم بتحديد النموذج التطوري واختيار عدد الأجيال المراد تشغيلها. وبعد إجراء التحليل باستخدام الأمر mc mc، قم بتلخيص الأشجار باستخدام الأمر sum T لعرض شجرة تطور سلالي. قم بتنزيل برنامج عرض الأشجار.

وكملاحظة ختامية، تصدر باستمرار تحديثات لبرمجيات جديدة تهدف إلى توفير محاذات أفضل، أو تنبؤات بالتشابه، أو أشجار تطور سلالي. وبينما غطت النظرة العامة في هذا الفيديو البرامج الشائعة، فإننا نشجع المشاهد على استكشاف خيارات إضافية. تقوم خوارزمية blast بإجراء محاذات محلية، والتي تبحث عن مقاطع قصيرة من تشابه التسلسل.

بعد أن يقوم الخوارزمي بالبحث عن جميع المقاطع الممكنة من تسلسل الاستعلام وتوسيع هذه التسلسلات إلى أقصى حد، فإنه يقوم بتجميع المحاذات. وبالنسبة لكل زوج من تسلسلات الاستعلام، تعطي قيمة e مؤشراً على الدلالة الإحصائية للمطابقة؛ فكلما انخفضت قيمة E، زادت دلالة أهمية التطابق.

على سبيل المثال، يعني محاذاة التسلسل بقيمة E تبلغ 0.05 أن احتمالية حدوث هذا التطابق عن طريق الصدفة وحدها هي خمسة من 100. وتستخدم درجة BIT مصفوفة تسجيل محددة لتقديم مؤشر على مدى جودة المحاذاة؛ فكلما ارتفعت درجة BIT، كانت المحاذاة أفضل.

يُعد محاذاة التسلسلات المتعددة (MSA) عملية محاذاة لتسلسلين أو أكثر من التسلسلات الأولية المكونة من الأحماض الأمينية أو DNA أو RNA. وتعمل مخرجات برنامج T-Coffee الموضحة هنا على ترميز البقايا المتشابهة بالألوان. ويظهر هنا نموذج لمحاذاة ستة تسلسلات بروتينية تم محاذاتها باستخدام برنامج Clustal X لتمثيل محاذاة الأحماض الأمينية.

يُستخدم برنامج protest لتحديد اختيار أفضل النماذج ملاءمة لاستبدال الأحماض الأمينية. وضمن البيانات، يسرد البرنامج النماذج أثناء تحليلها ويعرض النموذج الأكثر ملاءمة بعد اكتمال البرنامج، بينما يقوم Phi ML بتقدير أشجار تطور السلالات باستخدام أقصى احتمالية من محاذاة تسلسلات النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية. وهو يدمج عدداً كبيراً من نماذج الاستبدال المقترنة بخيارات متنوعة للبحث في مساحة تضاريس الشجرة.

يستخدم برنامج Mr.Bayes استدلال CMC البايزي عبر عدد من النماذج التطورية لإعادة بناء العلاقات الفيلوجينية. وبمجرد تشغيل البرنامج، يمكن عرض التقدم في فترات زمنية محددة كما هو موضح هنا. وبمجرد توليد الشجرة الفيلوجينية، يجب تصور الطوبولوجيا الخاصة بها.

في هذا الشكل، تعرض نافذة عرض الشجرة شجرة عينة من البروتينات من fly.Base. يتضمن عرض الشجرة محرراً للشجرة يتيح للمستخدم نقل الفروع وإعادة توجيه الأشجار. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر القراءة المتأنية لأدلة المستخدم الخاصة بكل برنامج.

يوفر هذا البروتوكول نقطة بداية عملية لتعريف القارئ بكيفية عمل هذه البرامج. ومع ذلك، أشجع القارئ على التجربة والتعرف على الإعدادات المتعددة المرتبطة بكل برنامج.