حقن العقدة داخل الليمفاوية من جزيئات البوليمر القابلة للتحلل الحيوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إيداع جزيئات لقاح المواد الحيوية في الغدد الليمفاوية باستخدام تقنية الحقن المباشر. أولا ، قم بتصنيع جزيئات البوليمر المستقرة بالدهون باستخدام طريقة مستحلب مزدوج. ثم اغسل الجزيئات وقم بقياس خصائص المواد مثل الحجم أو البضائع أو التحميل أو الاستقرار.

بعد ذلك ، قم بإدارة صبغة تتبع في قاعدة ذيل الفأر للسماح بالتصور بعد تصريف الصبغة إلى العقدة الليمفاوية. الخطوة الأخيرة هي تحديد العقدة الليمفاوية المسماة D وحقن كمية صغيرة من جزيئات البوليمر في هذا الموقع. يمكن استخدام الأنسجة والتألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر لتأكيد وجود وتوزيع الجسيمات في الغدد الليمفاوية الأربية.

يتيح الجمع بين الحقن المباشر للغدد الليمفاوية والمواد الحيوية للتطعيم تحكما صارما في تركيبات وجرعات مكونات اللقاح في البيئة المكروية للعقدة الليمفاوية ، ويسمح بإطلاق متحكم فيه للشحنة في هذه الأنسجة. يجب أن تصل جميع اللقاحات إلى الغدد الليمفاوية لتكون فعالة. لذا فإن تحديد كيفية تأثير المواد الحيوية والإشارات المناعية المدمجة على إشارات العقدة الليمفاوية المحلية أمر مهم لربط هذه الأحداث بالاستجابة المناعية الجهازية.

ستساعدنا هذه المعرفة على فهم أفضل لكيفية إدارة لقاحات المواد الحيوية على طول الطرق التقليدية. على الرغم من أن توصيل المواد الحيوية داخل العقدة الليمفاوية يعمل كأداة لدراسة تأثيرات المواد الحيوية على تنظيم الغدد الليمفاوية ، إلا أن هذه المنصة توفر أيضا فرصة تطبيقية لتطوير لقاحات علاجية وعلاجات مناعية جديدة تستهدف السرطان واضطرابات المناعة الذاتية. بالنسبة للجسيمات الدقيقة ، فإن المرحلة العضوية التي تحتوي على دهون البوليمر وغيرها من البضائع غير القابلة للذوبان في الماء على الجليد عند 12 واط.

لإنشاء مستحلب الماء والزيت ، أضف 500 ميكرولتر من H2O أو H2O المقطر الذي يحتوي على ملليغرام واحد من بروتين الببتيد أو أي شحنة أخرى قابلة للذوبان في الماء. استمر في الزنا لمدة 30 ثانية. هز القارورة برفق لأعلى ولأسفل من جانب إلى آخر حول طرف المحرك لضمان الاستحلاب الكامل.

الآن قم بإعداد الماء والزيت في مستحلب الماء عن طريق صب مستحلب زيت الماء في 40 مل من H2O متجانسة لمدة ثلاث دقائق عند 16،000 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف قضيب تقليب مغناطيسي وحرك الماء والزيت في مستحلب الماء طوال الليل لإزالة المذيب الزائد بعد إزالة المذيب طوال الليل. صب المستحلب من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون 40 ميكرون في جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي سعة 50 مليلتر لمدة خمس دقائق ، وصب المادة الطافية ، وإعادة تعليق حبيبات الجسيمات في مليلتر واحد من الماء ونقل الجسيمات العالقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

اجمع الجسيمات عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق. قياس حجم الجسيمات عن طريق حيود الليزر أو تشتت الضوء. حجم الماء المضاف إلى خلية الكسر عند مستوى كاف لمحاذاة وطمس الماصة 10 ميكرولتر من تعليق الجسيمات في خلية الكسر.

أغلق باب حجرة محلل حجم الجسيمات. ثم قم بقياس حجم الجسيمات ل PLGA. استخدم معامل الانكسار 1.60.

استخدم واجهة البرنامج لحساب قطر الجسيمات باستخدام أساس رقمي قبل يوم واحد من الحقن. قم بتخدير الفأر وفقا لبروتوكول حيواني معتمد من iacuc. تقييم عمق التخدير بإصبع القدم.

بإجراء اختبارات الانعكاس ومراقبة التنفس لضمان معدل تنفس يتراوح من 100 إلى 120 نفسا في الدقيقة. احلق الشعر عند قاعدة الذيل والربع الخلفي. قم بإزالة الشعر من الجانب البطني للحيوان وبشكل جانبي إلى الجانب الظهري فوق مفصل الساق الخلفية مباشرة.

لكل حقن صبغة ، استخدم ماصة صغيرة لنقل 10 ميكرولتر من محلول الصبغة إلى أنبوب فوج ميكروسنتر وشفط 10 ميكرولترات بالكامل من خلال إبرة قياس 31 إلى حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد. الآن قم بحقن 10 ميكرولترات من محلول الصبغة تحت الجلد على كل جانب من قاعدة الذيل للتحميل بين الحقن. ضعي كريما خفيفا لإزالة الشعر لإزالة الشعر المتبقي.

تأكد من تغطية المنطقة الواقعة بين الساق الخلفية والبطن. بعد ثلاث دقائق ، استخدمي يد قفازات مبللة مع H two oh دافئ وافركي كريم إزالة الشعر برفق على الجلد. كرر على الفور لإزالة إزالة الشعر الزائدة.

بعد ذلك ، بلل قطعة قماش ناعمة أو منشفة ورقية بالماء الدافئ وبحركة واحدة امسح الجزء السفلي من الماوس. ضع الماوس تحت مصباح حراري للتعافي ثم عد إلى التثبيت لمدة 12 ساعة على الأقل. افحص الفأر المخدر للتأكد من تصريف الأثر أو الصبغة في كل عقدة ليمفاوية إربية.

يجب أن تكون العقدة الليمفاوية مرئية كبقعة داكنة بالقرب من الفخذ الخلفي والبطن. الآن إعادة تعليق الجسيمات في الماء المقطر عند تركيز الحقن المطلوب لكل حقنة. استخدم ماصة صغيرة لنقل 10 ميكرولتر من محلول الجسيمات إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

استنشق 10 ميكرولتر بالكامل في إبرة أنسولين قياس 31 متصلة بحقنة مليلتر واحد. اسحب الجلد مشدودا حول العقدة الليمفاوية المصبوغة بالإبرة بزاوية 90 درجة على الجلد. اخترق الجلد حتى عمق ملليمتر واحد.

حقن ببطء مراقبة الحجم بالكامل لتضخم العقدة الليمفاوية المرئية. اسمح للماوس بالتعافي تحت مصباح حراري ثم عد إلى الإمساك أو إجراء اختبارات إضافية. أولا ، تأكد من تخليق الجسيمات وتوزيع الحجم.

يمكن تقييم بروتوكول تخليق تبخر مذيبات المستحلب نوعيا عن طريق الفحص البصري للمستحلبات النهائية. انشاء. يجب أن تكون المستحلبات معلقة متجانسة خالية من الركام المرئي. يمكن تأكيد توزيع حجم الجسيمات الجزئية عن طريق حيود الليزر أو تشتت الضوء الديناميكي يجب أن تظهر عينات الجسيمات توزيعا أحادي الشكل.

يمكن تحقيق مزيد من التقييم النوعي لتخليق الجسيمات من خلال تعديل البروتوكول لدمج شحنة فلورية واحدة أو أكثر ، مثل الببتيد الفلوري أو الصبغة المحبة للدهون. يمكن استخدام الصبغة لتحديد موقع العقدة الليمفاوية واستهدافها لحقن الجسيمات أثناء التدريب ، قد يتم القتل الرحيم للفئران وتشريحها بعد حقن الصبغة لاكتساب التعرف على مواقع العقدة الليمفاوية. يتم تأكيد توزيع الجسيمات داخل مناطق الخلايا التائية والبائية للعقدة الليمفاوية المصابة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للغدد الليمفاوية المقطعة والملطخة.

يمكن ملاحظة الاختلافات في خصائص الجسيمات مثل الحجم في الغدد الليمفاوية بعد الحقن والتصوير بالفحص المجهري الفلوري بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية على مدار يومين. يحدث تخليق الجسيمات وإعداد في اليوم الأول. يتم إجراء توصيف غسل الجسيمات وحقن العقدة الليمفاوية داخل اليوم الثاني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الأثر أو الصبغة لتصور وحقن الغدد الليمفاوية الأربية للفئران. تتيح هذه التقنية التوصيل غير الجراحي لناقلات لقاح المواد الحيوية مباشرة إلى العقدة الليمفاوية بمستوى تحكم لم يكن ممكنا من قبل. سيسمح التوصيل المباشر للعقدة الليمفاوية للمواد الحيوية للعلماء والمهندسين وعلم المناعة وتطوير اللقاحات باستكشاف التفاعلات الأساسية للمواد الحيوية واللقاحات والإشارات المناعية مع العقدة الليمفاوية ، مما يلقي ضوءا جديدا على الآليات التي تحفز بها هذه المواد المناعة وتشكل المناعة.