Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية في المختبر

الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوارض بعد الولادة منقاري تيار المهاجرة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل الخلايا العصبية الأولية بعد الولادة من أجل فحص تأثير البروتينات المستهدفة على هجرتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الخلايا العصبية أولا من التيار المهاجر المنقاري للقوارض الملوثات العضوية الثابتة. الخطوة الثانية هي فصلها ونقلها عن طريق المودة النووية إما مع الحمض النووي أو S-H-R-N-A.

بعد ذلك ، يتم إعادة تجميع الخلايا العصبية في قطرات معلقة ثم يتم زراعتها في التعليق لفترة مناسبة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تضمين مجموعات الخلايا العصبية المجمعة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وتركها للهجرة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي أو التصوير بفاصل زمني لتحليل هجرة الخلايا العصبية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال تكوين الخلايا العصبية ، مثل التحكم في هجرة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية في دماغ ما بعد الولادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة وسريعة نسبيا مقارنة باستخدام النواقل الفيروسية ، والتي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا. بعد التضحية ب P ستة إلى P سبعة فضلات الفئران ، قم بعمل شق خلفي في الجلد على طول خياطة منتصف السهمية من الأنف إلى المخيخ بشفرة مشرط على كل فأر.

بعد ذلك ، قشر الجلد. كرر نفس الشق على طول الجمجمة. ثم قم بإزالة اللوحات الجمجمة برفق باستخدام ملقط وقم بإزالة الدماغ بعناية مع المصابيح الشمية باستخدام ملعقة.

بعد ذلك ، قم بقص ثلث الدماغ الأكثر دللا وتخلص منه. بعد ذلك ، قم بتقطيع أنسجة المخ إلى شرائح إكليلية بسمك 1.4 ملم باستخدام مفرمة الأنسجة. انقل الشرائح إلى طبق يحتوي على وسط تشريح بارد.

ثم اعرض الشرائح تحت مجهر التشريح. افصلهم بعناية باستخدام إبرة. يظهر التيار المهاجر المنقاري كمنطقة شفافة مثلثة في وسط أقسام OB وكمنطقة دائرية صغيرة.

في شرائح الدماغ الأكثر دللا ، قم بقص RMS من كل شريحة بسكين جراحي مجهري مع الحرص على تجنب تضمين الأنسجة المحيطة. بعد ذلك ، اجمع شظايا RMS بماصة بلاستيكية وضعها في طبق صغير يحتوي على وسط تشريح بارد على الجليد. ثم قم بتدوير الطبق برفق لتجميع شظايا RMS في وسط الطبق.

اجمع الأجزاء بماصة بلاستيكية وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اترك الشظايا لتستقر في قاع الأنبوب. استبدل وسط التشريح بملليلترين من وسط التفكك T tri.

قم بتقييم شظايا RMS عن طريق سحب تعليق الشظية برفق لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات باستخدام ماصة P 1000 بعد ذلك. اترك الأنبوب مع شظايا الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بتقطيع المحلول مرة أخرى 10 مرات وتأكد من تفكك الشظايا.

ثم قم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من DMEM المصابة مسبقا بالإضافة إلى 10٪ FCS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 433 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الوسيط الزائد وإعادة الضغط. قم بتعليق حبيبات الخلية عن طريق ماصتها برفق في مليلتر واحد من DMEM الدافئ بالإضافة إلى 10٪ FCS ، ثم أضف أربعة ملليلتر أخرى من نفس الوسط.

ثم قم بإجراء عدد الخلايا. مطلوب ما لا يقل عن 2.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل عاطفة نواة بينما يتم تحقيق النتائج المثلى. باستخدام ثلاثة إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل عاطفة نواة.

الطرد المركزي معلق الخلية عند 433 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط في هذا الإجراء. على الفور ، قم بتعليق حبيبات الخلية في محلول عاطفة نواة الخلايا العصبية للفئران الذي تم احتضانه مسبقا.

في درجة حرارة الغرفة ، انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل أنبوب استخلاص للنفط يحتوي على SI R-N-A-D-N-A. ثم امزجها برفق عن طريق سحب العينات مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام ماصة P 200. بعد ذلك ، أضف العينة إلى الجزء السفلي من النواة مع الحرص على تجنب توليد أي فقاعات.

بالنسبة لعاطفة النواة ، استخدم برنامج G dash 0 1 3 لخلايا الفئران أو O dash 0 0 5 لخلايا الفأر. بعد ذلك ، أضف بسرعة ملليلترا واحدا من DMEM قبل الحرب بالإضافة إلى 10٪ FCS إلى العينة المصابة بالنواة. انقل العينة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من DMEM قبل الحرب بالإضافة إلى 10٪ FCS باستخدام الماصة البلاستيكية التي توفرها مجموعة المودة النووية.

ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 433 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة جميع الوسائط الزائدة بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 25 إلى 30 ميكرولتر من DMEM قبل الحرب بالإضافة إلى 10٪ FCS باستخدام ماصة P 20. لا تستخدم أكثر من 30 ميكرولتر من المتوسط.

بعد ذلك ، قم بسحب التعليق كقطرة على الجانب الداخلي لغطاء الطبق P 35. ثم اقلب الغطاء فوق طبق P 35 الذي يحتوي على ملليلترين من الوسط الكامل. اتركه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات على الأقل.

بعد خمس ساعات ، انقل القطرات المعلقة من الغطاء إلى الوسط الكامل في الطبق. باستخدام ماصة P 1000 بطرف مقطوع. ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للعدوى النووية للحمض النووي NU ، أو 48 ساعة للتأثيرات النووية ل SI A

الآن قم بإعداد 25 مل من الوسط الكامل والتوازن المسبق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لبضع ساعات. في غضون ذلك ، أخرج الحصص المجمدة لمصفوفة الغشاء القاعدي من الفريزر سالب 80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد في الغرفة الباردة. لكل عاطفة نواة ، قم بإعداد طبق بطول ستة سنتيمترات يحتوي على ما يصل إلى ثماني زلات غطاء معقمة مقاس 13 ملم.

ضع الأطباق على صندوق ثلج مغطى بغشاء بلاستيكي. للحفاظ على الرطوبة ، ضع شريطا من الأنسجة الرطبة داخل طبق طوله 15 سم والذي سيتم استخدامه لاستيعاب ما يصل إلى ثلاثة أطباق بطول ستة سنتيمترات تحتوي على أبلاستات مدمجة في الركبة. بعد ذلك ، أضف الوسط الكامل إلى مصفوفة هاو بنسبة واحد إلى ثلاثة ، وانقل مجموعات الخلايا المجمعة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي 433 مرة G لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط الزائد وإعادة تعليق البليت في 10 ميكرولتر من الوسط الكامل. ثم ضع ميكرولترين من تعليق ركام الخلية على كل زلة غطاء معقمة. أضف 18 ميكرولترا من خليط المصفوفة المتوسط الكامل واستخدم طرف الماصة لنشر المصفوفة على الغطاء بالكامل.

انزلق مباشرة بعد وضع الطبق الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات والذي يحتوي على زلات الغطاء في الطبق الذي يبلغ طوله 15 سم. انقل الطبق إلى الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد أن تصلب المصفوفة ، أضف برفق خمسة ملليلتر من الوسط الكامل إلى كل طبق يبلغ طوله ستة سنتيمترات وادفع أي زلات غطاء عائمة مع طرف الماصة ثم تحضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ كربوجين للسماح للأرومة العصبية بالهجرة خارج مجاميع الخلية.

في هذا الشكل ، تظهر خلايا RMS المعزولة للفئران إيجابية للمناعة لعلامات الخلايا العصبية المهاجرة DCX وبيتا ثلاثة توبولين. ويوضح هذا الشكل أن علامات الخلايا العصبية المهاجرة DCX و PSA NCA يتم التعبير عنها في الخلايا المهاجرة من الفأر. RMS Explan للفأر Neuroblast Nu المودة النووية ، تأثرت الخلايا العصبية RMS الفأر المنفصل بإعادة تجميع GFP المضمنة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وسمح لها بالهجرة لمدة ست ساعات.

تظهر الخلايا العصبية التي تهاجر من مجموعة الخلايا المجمعة كفاءة عالية في التعدين. هنا ، تأثرت الخلايا العصبية للفئران بالنواة بلازميدين مختلفين يشفران GFP المعاد تجميعهما في المصفوفة وتركها للهجرة لمدة 24 ساعة. ثم تم تثبيت الخلايا وصبغها المناعي ل GFP و beta three tubulin لقياس مسافة الهجرة.

تنقسم مجموعة الخلايا المجمعة إلى ستة قطاعات متساوية ويتم قياس المسافة بين حافة الكتلة وأبعد خلية مهاجرة لكل قطاع. يوضح هذا الشكل القياس الكمي للمسافة النسبية التي تم ترحيلها بواسطة الخلايا المصابة بالنواة الإيجابية GFP والتحكم في الخلايا غير المصابة بالنواة السلبية GFP لمراقبة هجرة الخلايا العصبية. بعد S-H-R-N-A تتأثر الخلايا العصبية للفئران ذات النواة بناقل تحكم S-H-R-N-A أو نفس الناقل الذي يحتوي على HRNA المستهدف ، تم إعادة تجميع خلايا البروتين التي تجمع على مدار 48 ساعة مدمجة في المصفوفة وتركها للهجرة لمدة 24 ساعة.

ثم تم إصلاح الركام وصبغة مناعية ل GFP وبيتا ثلاثة توبولين. يمكن الكشف عن استنفاد التثبيت الفعال بعد 50 ساعة من عاطفة نوى S-H-R-N-A بواسطة Western Blood Analysis و Acton يظهر هنا كعنصر تحكم في التحميل. فيما يلي التحليل الكمي لمسافة الهجرة النسبية التي تظهر أن النضوب المثبت يضعف بشكل كبير هجرة الخلايا العصبية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التثقيب الكهربائي بعد الولادة للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها في الجسم الحي باستخدام مقايسة هجرة المودة النووية NU.