التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسهيل تحديد أحداث الاستئصال مع مجموعة سكانية فرعية من الأرومة الحمراء. تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء مجموعة سكانية غنية بأحداث النواة. يتم تحقيق ذلك عن طريق مزرعة تكون الكريات الحمراء في المختبر ، إما على المدى الطويل بدءا من خلايا نخاع العظام منخفضة الكثافة المعزولة من عظم الفخذ والساق وعظام الحوض للفأر غير المجهد أو الثقافة قصيرة المدى.

بدءا من ple cytes من طحال الفأر الذي تعرض سابقا لبضع الفصد من أجل تكوين الكريات الحمراء الإجهادية. يتم تثبيت الخلايا المستنبتة في الخطوة الأخيرة من المزرعة وتغلغلها وتلطيخها بعلامات الفلورسنت ذات الأهمية. يتم تشغيل هذه الخلايا على مقياس تدفق التصوير الخلوي ثم تحليلها لتحديد الخلايا التي تخضع للاستئصال في مجموعة الخلايا النووية ، ويمكن تحديد إشارات الإشارات والهيكل الخلوي التي تنظم وتتوسط عملية الاستئصال.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري الفلوري ، هي أنه يمكن ملاحظة وتحليل العدد الأكبر بكثير من الخلايا النووية في فترة زمنية قصيرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكون الكريات الحمراء ، مثل الآليات الجزيئية التي تشارك في نواة الأروبة الحمراء. للتمييز بين خلايا الكريثرويد الحمراء وخلايا نخاع العظم منخفضة الكثافة ، ابدأ بإضافة مليلتر واحد من وسط المزرعة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي المعقم.

ثم قم بتوصيل إبرة قياس 25 × خمسة أثمان بوصة بحقنة السل وقم بغسل وسائط الثقافة الطازجة برفق من خلال عظم الفخذ والساق المحصودة عدة مرات في أنبوب قياس التدفق الخلوي. بعد ضبط حجم تعليق الخلية إلى خمسة ملليلتر باستخدام IMDM ، ضع طبقة بعناية على خمسة ملليلتر من 1.083 جرام لكل مليلتر من وسط فصل الخلايا المتدرجة في أنبوب 15 ملليلتر. انقل كل شيء إلى علامة المليلتر إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر واغسل معطف بافي الذي تم جمعه بقمل وسائط الثقافة الطازجة خلايا الدم الحمراء في ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد غسل الخلايا في وسائط الثقافة وتعليق الحبيبات في نفس اللوحة ، الخلايا الموجودة في صفيحة زراعة من ستة خلايا بتركيز خمسة أضعاف 10 من الخلايا الخامسة لكل بئر إلى حجم نهائي قدره 2.5 مل في وسط النمو وتحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية بعد خمسة أيام من طلاء المزرعة.

احسب عدد الأرومات الحمراء في كل بئر من لوحة الثقافة الأصلية ثم انقل كل بئر إلى أنابيب مخروطية فردية 15 ملليلترا. بعد تدوير الخلايا ، استنشق المواد الطافية وأعد تعليق الكريات في وسط نمو جديد يحتوي على الإريثروبويتين فقط بتركيز مرتين في 10 من الخلايا الخامسة لكل مليلتر. ثم استنشق المادة الطافية من صفيحة من خمس خلايا لمرض التصلب العصبي المتعدد وأضف الخلايا الحمراء إلى الآبار.

بعد يومين ، استبدل المادة الطافية بوسط نمو جديد بدون السيتوكينات التي تحل للأرومات الحمراء من خلايا PLE منخفضة الكثافة. استخدم المكبس من حقنة سعة خمسة ملليلتر لنقع الطحال من خلال مصفاة 40 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلترا. اغسل مصفاة الخلية بوسائط النمو واضبط الحجم النهائي لتعليق الخلية إلى خمسة ملليلترات.

ثم بعد فصل طبقات الخلايا عن طريق تدرج الكثافة كما هو موضح للتو ، قمل خلايا الدم الحمراء واغسل الخلايا في سبعة ملليلتر من وسط الزراعة. ثم يقوم Resus بتعليق الحبيبات في وسط النمو المكملة بالسيتوكينات واحتضان الخلايا من واحد إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست في حجم نهائي قدره مليلتر واحد لكل بئر من لوحة ثقافة خلية 24 جيدا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي.

انقل الخلايا إلى آبار تحتوي على خمس خلايا متصلبة بالتصلب العصبي المتعدد كما هو موضح سابقا وقم بتحليلها بعد ست إلى ثماني ساعات ، وجمع الخلايا الحمراء من آبار الاستزراع وإصلاحها في 500 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد في PBS Resus ، مع تعليق الحبيبات بسحب لطيف. بعد 15 دقيقة ، قم بتدوير الخلايا عند 2000 GS لمدة 20 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير ، وشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS. بعد تدوير الخلايا في جهاز الطرد المركزي الصغير ، مرة أخرى ، قم بشفط المادة الطافية مرة أخرى وضع الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل.

ضع محاليل الأسيتون المخزنة 20 درجة مئوية تحت الصفر على الجليد. ثم قم بإعادة تعليق الخلايا وتدويرها بسرعة في سلسلة من غسول الأسيتون كما هو موضح بعد غسل الفاكس العازلة ، واحتضان كريات الخلية في 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم بعد غسل الخلايا في مخزن الفاكس المؤقت مرة أخرى ، أعد تعليق الكريات المستمرة في 60 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفاكس الذي يحتوي على drac five وقم بتشغيل العينات على مقياس تدفق التصوير الخلوي الذي يجمع ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة تجريبية.

ثم ابدأ التحليل عن طريق تحديد الخلايا بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع الخاصة بها ، ونسبة طول محورها الصغير مقابل محورها الرئيسي ومساحة المجال الساطع ، مما يدل على حجمها. الأحداث ذات قيمة مساحة المجال الساطع أقل من 20 وأعلى من 200 هي في الغالب مجاميع حطام وخلايا على التوالي ويتم استبعادها من التحليل. ثم يقوم بتحليل الخلايا المفردة بناء على قيمتها لمعلمة RMS المتدرجة ، والتي تشير إلى حدة الصورة ، لإنشاء بوابة ثانية تحتوي على الخلايا ذات قيمة RMS المتدرجة أكبر من النسبة المئوية 50 من أجل تحديد الصور التي تم التقاطها بشكل جيد في التركيز.

البوابة التالية ، الخلايا بناء على حجمها كما تم قياسها من خلال مساحة المجال الساطع وإيجابيتها لعلامة الكريات الحمراء TER واحد 19 كما تم قياسها بواسطة TER one 19 صبغة فلورية متوسطة خلايا معلمة بكسل منخفضة جدا أو عالية جدا ل TER واحد 19 هي إما غير احمرار أو مجاميع خلايا متبقية على التوالي ويتم استبعادها من التحليل في الخطوة التالية. يتم اختيار الخلايا بناء على كثافة نسبة العرض إلى الارتفاع الخمسة DR ، ونسبة المحور الصغير مقابل المحور الرئيسي لنواتها وشدة تعبيرها d dr خمسة. DR خمس خلايا سالبة معظمها خلايا مفصولة مثل الخلايا الشبكية وخلايا الدم الحمراء والخلايا ذات نسبة العرض إلى الارتفاع المنخفضة لخمسة السحب.

في الغالب يتم استبعاد الزوجات من مشية التحليل. تسحب خمس خلايا موجبة للحمض النووي ، والتي تكون في الغالب أرومات حمراء في هذه المرحلة. ثم يتم تحليل هذه الأرومات الحمراء بناء على مساحة TER one 19 ، مما يشير إلى حجم الخلية و TER واحد 19 متوسط مساحة البكسل أو كثافة تعبير TER واحد 19 ، مما يشير إلى سطوع تلطيخ TER one 19.

ميزت [أورث] [رثرومتيك ريثروروس] كصغيرة [تر] واحدة 19 خلايا عال. أخيرا ، تتميز مجموعة سكانية فرعية من الأرومات الحمراء اللونية العظام بنسبة العرض إلى الارتفاع المنخفضة وارتفاع دلتا سينتو XY TUR واحد 19. DR خمسة كما هو محدد من خلال المسافة بين مركز الخلية الشبكية الإيجابية الأولى TUR واحد 19 ومركز DR خمسة نواة موجبة جنبا إلى جنب مع الجسم المضاد ضدها 19 وصبغة الحمض النووي DRAAK خمسة.

عادة ما يتم تلطيخ الخلايا أيضا لتحديد توطين f actin أثناء الأرومة الحمراء والتنوى. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تصور تطور الاستئصال كخلايا ذات نسبة عرض إلى ارتفاع متناقصة. هذه هي الخلايا التي تصبح ممدودة بشكل متزايد ومع زيادة دلتا OID xy TUR واحد 19 يسحب خمسة.

يتركز الأكتين F عند ثلم الانقسام أثناء التنوي ثم يتبدد بمجرد بثق النواة. يمكن أيضا تلطيخ البروتينات والهياكل الأخرى ذات الأهمية بالأجسام المضادة المناسبة أو علامات الفلورسنت للسماح بتصوير أدوارها أثناء الاستئصال. على سبيل المثال ، يمكن تصور تكوين الأنابيب الدقيقة المستقطبة في الأرومات الحمراء اللونية من النوع البري قبل التنوي ، ولكن ليس في الأرومات الحمراء المعالجة بالكولشيسين.

يؤدي تثبيط بلمرة التوبولين بواسطة الكولشيسين إلى تقليل استقطاب الخلية كما هو موضح من خلال قياس المعلمة دلتا OID XYB FDR خمسة بين مركز جسم الخلية الذي شوهد في قناة برايتفيلد ومركز التلوين النووي الذي تم تحقيقه باستخدام DR خمسة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري للإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة المشاركة في تكون الكريات الحمراء مثل تلك التي لوحظت في جزر الأرومة الحمراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور أحداث الاستئصال في السكان المخصبين بالأرومات الحمراء.