عزل الغدد متعددة الخلايا القابلة للحياة من أنسجة النبات آكل اللحوم ، Nepenthes

يتمثل نطاق الطريقة المعروضة في الحصول على غدد مفردة ونقية من أنسجة نباتية طازجة لإجراء التحليل الجزيئي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال حصاد إبريق من نبات nepenthe. بعد ذلك، يتم تثبيت النسيج مباشرة على منصة أخذ عينات مجهرية على الثلج للحفاظ على نضارة النسيج.

خلال إجراء أخذ العينات الدقيقة، يتم عزل الغدد بطريقة دقيقة ونقلها إلى أنبوب PCR قبل إجراء تحليل PCR الكمي على المادة التي تم جمعها. وفي النهاية، تُستخدم تقنية أخذ العينات الدقيقة الميكانيكية للحصول على غدد مفردة ونقية من نباتات napes من أجل توفير أنسجة محددة بسرعة وبأقل قدر من التدخل الجراحي لإجراء المزيد من التحليلات الجزيئية. وتعتبر النباتات المفترسة متخصصة بين النباتات لأنها قادرة على هضم البروتين الحيواني.

لا تزال معرفتنا بكيفية عمل ذلك على المستوى الجزيئي محدودة. ويعد النموذج المتمثل في مزيج صور الزائدة الدودية نموذجاً جيداً لمعالجة هذا السؤال، لأنها تحتوي على أعضاء متميزة، وصور تنتج غدداً تساهم في عمليات الهضم هذه في الزائدة الدودية.

تقع هذه الغدد داخل الصور الموضحة في الأسفل. ولإجراء التحليل الجزيئي، من الضروري عزل هذه الهياكل العريضة والمسطحة، التي يتراوح قطرها بين 100 إلى 200 micrometers مباشرة من النسيج الطازج. ومما يزيد الأمر صعوبة أن هذه الغدد مغطاة بغطاء واقٍ.

بسبب وجود بنية مشابهة للمظلة تتطلب ملاحظات ثلاثية الأبعاد أثناء أخذ العينات، بالإضافة إلى الحاجة لأداة يمكنها التحرك في ثلاثة أبعاد بدقة، وجدنا أن تقنيات التشريح الدقيق الحالية لم تكن مصممة لحل مشكلاتنا. فعلى سبيل المثال، أخفق استخدام الليزر بسبب المحتوى المائي العالي في أنسجة النبات.

وبناءً على ذلك، قررنا استخدام وتوظيف تقنية تشريح مجهري ميكانيكية جديدة تسمى aika، وتحديداً لعزل أجزاء من الأنسجة أو حتى خلايا مفردة من هياكل ثلاثية الأبعاد. وتتكون هذه التقنية من مجهر ستيريو أو مجهر تجميعي حيث يتم دمج مُحرك مجهري ثلاثي الأبعاد بطريقة تمكنه من الوصول بسهولة إلى الأجسام المسطحة جداً أو المرتفعة جداً. وهو يتحرك بالتزامن مع المجهر كدعامة واحدة، وبالنسبة للعينات النباتية، غالباً ما نستخدم الشعيرات المجهرية.

ومع ذلك، في حالة الزجاج الملحق، وجدنا أن الملاقط الدقيقة التي تعمل بنظام PTO كانت أكثر فعالية في إجراءاتنا. وبالنسبة للملحق، فقد تم تعديل المنصة؛ حيث تدعم منصة VXY صغيرة حاوية تقرير مملوءة بالثلج، تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب كل من عينة النسيج مع حاملها وكذلك المكان الذي سيتم فيه وضع الغدة.

يضمن الثلج إبطاء عمليات التحلل داخل النسيج إلى حد يتيح التعرف على الحالة الجزيئية الأصلية للنسيج. تم تأسيس الإجراء التالي من الجزء السفلي من الصورة؛ حيث يتم استئصال قطعة تبلغ مساحتها حوالي 1 إلى 2 سنتيمتر مربع ثم يتم بسطها.

يتم بعد ذلك تثبيت النسيج على شريحة زجاجية باستخدام شريط لاصق ذي وجهين. تُغطى عينة النسيج هذه بماء خالٍ من الـ RNAs ويتم الحفاظ عليها رطبة خلال عملية أخذ العينات. ثم يتم وضع العينة بحيث تكون الغدد وأغطيتها الواقية مواجهة لجانب جهاز المناولة.

يجب ضبط الزاوية بين العينة والأداة بحيث تكون الغدد في وضع مسطح. وباستخدام منصة عالمية، يمكن ضبط الإمالة في محورين وتصحيحها بسهولة تحت المجهر. وتحافظ المنصة المعدنية على برودة العينة تحت المجهر.

تظهر الغدد مميزة بوضوح. ويساعد التألق في التعرف بسهولة على المخطط الخارجي لكل من الغدة والغطاء الواقي. يتم فحص العينة عبر مرشح FSE لعزل الغدد.

يُستخدم مرشح الأشعة فوق البنفسجية (UV filter) لاستخلاص الـ RNA. ويُعد التحديد الدقيق جداً لموضع الملقط الدقيق أمراً ضرورياً لعزل الغدة. ويُنصح بتشغيل الأداة في وضع السرعة المنخفضة.

باستخدام الملاقط الدقيقة، يتم الاقتراب من الغدة ووضع ذراعي الملقط عند حدودها بواسطة عصا التحكم، ثم تُغلق الملاقط الدقيقة برفق. بعد ذلك، تُرفع الغدة عن الأنسجة المحيطة بها. وبعد عزلها بدقة، يمكن رؤية التجويف السليم وهو يظهر الأنسجة الوعائية الكامنة تحته.

تُنقل الغدة المعزولة بعد ذلك إلى أنبوب PCR وتوضع في المحلول المنظم المُحضّر. وللتحقق من صحة هذه الطريقة، تم تحديد التعبير الجيني لبروتين atoma leg protein short، والمعروف اختصاراً بـ TAP، والذي يتم إفرازه في السائل الراتنجي؛ حيث يمكن تضخيم هذا الجين مباشرة من الغدد دون الحاجة إلى استخلاص مسبق للحمض النووي الجينومي (genomic DNA)، وذلك بمجرد إضافة خليط تفاعل PCR إلى النسيج المعزول.

تضمنت سلسلة التجارب غدداً من نباتات nepenthe عولجت بطرق مختلفة، بالإضافة إلى عينات من الأنسجة البشرية المحيطة بها. تم استخلاص الـ RNA الكلي لكل تجربة. ثم تم تحويل الـ mRNA الذي تم الحصول عليه إلى الـ CDNA المقابل عن طريق النسخ العكسي، واستُخدم في تفاعل PCR اللاحق.

لتضخيم تسلسل الجين المستهدف، استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (realtime PCR) لمقارنة مستوى تعبير TLP في غدد وبشرة نباتات nepenthes. وتظهر النتائج أن مستوى نسخ TLP يكون أعلى في الغدد الإفرازية مقارنة بأنسجة البشرة في كل من nepenthes allotta و nepenthes miis، كما يتضح من نسبة أنسجة البشرة إلى أنسجة الغدد التي كانت أقل من واحد، وذلك لاختبار ما إذا كان التلامس مع الفريسة يمكن أن يحفز التعبير الجيني. وقد تمت مقارنة مستويات نسخ TLP والصور غير المعالجة والصور التي غُذيت بـ drosophila melanogaster بعد اصطياد الفريسة.

أظهرت الأنسجة البشرية تعبيراً أعلى لـ TLP هنا. وتمت مقارنة مستوى نسخ TLP في الغدد والأنسجة البشرية وصورة معالجة لنبات nepenthes miis. ويشير ارتفاع تعبير TLP في كلا نوعي الأنسجة إلى أن إنتاج بروتينات سائل الإبريق يمكن تحفيزه بالفعل عن طريق الفريسة.

تشير نتائج PCR إلى أن التغذية تغير بشكل فعال من تعبير TLP في كلا نوعي الأنسجة، ويمكن أن تؤدي إلى إزاحة نسبة التعبير بين الغدة والبشرة. لقد طورنا طريقة فعالة لحصاد cleanse من نسيج الزائدة FA وعزلنا كمية كافية من mRNA لإجراء تجارب التعبير الجيني. وباستخدام هذه الطريقة الجديدة التي طورناها، لن يكون من الممكن دراسة الترانسكريبتوميكس في غدد الزائدة فحسب، بل يمكننا أيضاً دراسة الميتابولوميكس بالإضافة إلى البروتوميكس.I.