يتم التحكم في خصائص الهلاميات الدقيقة من البولي إيثيلين جلايكول المكونة من هطول الأمطار من خلال الوزن الجزيئي للمواد المتفاعلة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكوين هلامات دقيقة من البولي إيثيلين جليكول باستخدام تفاعل ترسيب بالبلمرة الضوئية لاستخدامها كناقلات لإيصال الأدوية وسقالات لهندسة الأنسجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير الكواشف، بما في ذلك بادئ ضوئي، ومحاليل منظمة، وتراي إيثيل أمين، ومحلول PEG DL، وتسخينها إلى 37 درجة مئوية. وتتمثل الخطوة الثانية في وضع الكواشف في أنبوب طرد مركزي دقيق ورجها بجهاز vortex مع الحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، يتم خلط كبريتات الصوديوم ووضع المحلول تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV light) لإجراء عملية الربط التشابكي لمدة 30 ثانية. بعد الربط التشابكي، ستتكون طبقة عكرة فوق المحلول تحتوي على الهلامات الدقيقة (micro gels). وتتمثل الخطوة النهائية في إضافة PBS إلى الخليط ثم استخدام جهاز الطرد المركزي لتكوين راسب.

في النهاية، يُستخدم المجهر وتشتت الضوء الديناميكي لقياس حجم الهلامات الدقيقة، بينما تُقاس الكثافة باستخدام تدرج كثافة الدكسترين. بالإضافة إلى ذلك، يتم حساب مقدار الانتفاخ عن طريق قياس الأوزان الرطبة والجافة للهلامات الدقيقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل تقنيات المستحلب والمعلق والتشتت، في أن الهلامات الدقيقة المتكونة عن طريق تفاعل الترسيب تتميز بمؤشر تشتت متعدد منخفض دون الحاجة إلى استخدام مذيبات عضوية أو مواد مثبتة، كما أن الظروف المعتدلة لتفاعل الترسيب، والخصائص القابلة للتخصيص للهلامات الدقيقة، واللزوجة المنخفضة للحقن تجعلها مناسبة لتطبيقات NVivo.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي، مثل تصنيع السقالات التي تتميز بحجم موحد ومؤشر تشتت متعدد منخفض. ويمكن أن تمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل العلاج بتوصيل الأدوية نظراً لإمكانية تغليف عوامل النمو الموجودة في الأدوية بسهولة. للبدء، قم بوزن 500 milligrams من البادئ الضوئي وأضفه إلى 100 milliliters من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول بتركيز 0.5%.

احمِ المحلول من الأشعة فوق البنفسجية وسخنه إلى 40 درجة Celsius مع التقليب المستمر لمدة ساعة تقريباً لإذابة البادئ الضوئي تماماً. بعد الذوبان الكامل، قم بترشيح المحلول تعقيمياً بتمريره عبر مرشح 0.22 micron واحفظه في درجة حرارة 4 درجات Celsius في الظلام حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، قم بتدفئة Triethylamine مسبقاً إلى 37 درجة Celsius لتقليل لزوجته.

بعد ذلك، أضف 612 µL منه مع 260 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 6 M إلى 39.4 mL من PBS واضبط الـ pH إلى 7.8 مع التعقيم. قم بترشيح المحلول النهائي عبر مرشح بمسامية 0.22 µm واحفظه عند درجة حرارة 37 °C حتى وقت الحاجة. وبناءً على عمل Sony et al.، يتم تحضير سلائف PEG وفقاً للطرق المنشورة وحفظ المنتج النهائي عند درجة حرارة -20 °C تحت غاز الأرجون، ثم مباشرة قبل الاستخدام، يتم تحضير 1 mL من محلول PEG diacrylate بتركيز 200 mg/mL عن طريق إضافة 0.8 mL من PBS المضاف إليه triethanolamine وحمض الهيدروكلوريك ببطء إلى 200 mg من PEG diacrylate.

كذلك، وقبل البدء في التجربة مباشرةً، زِن 213 milligrams من كبريتات الصوديوم وأذبها في one milliliter من الماء منزوع الأيونات. ولتحضير محلول بتركيز 1.5 molar، سخّن المحلول عند 37 degrees Celsius لمدة 20 minutes، ثم استخدم جهاز الـ vortex للمحلول حتى يذوب تماماً. وبمجرد الذوبان، قم بترشيح كل من محلول كبريتات الصوديوم النهائي ومحلول PEG di Acrylate عند 37 degrees Celsius باستخدام مرشحات 0.22 micron.

اجمع 127.5 µL من PBS مع ثلاثي إيثيل أمين وحمض الهيدروكلوريك، و10 µL من بادئ الضوء بتركيز 0.5%، و25 µL من محلول Peg di acrylate بتركيز 200 mg/mL في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.6 mL. ثم أضف أي جزيئات مرغوبة للتغليف.

قم بتسخين هذه الأنابيب مع محلول كبريتات الصوديوم بتركيز 1.5 molar إلى 37 درجة Celsius. بعد ذلك، أضف 87.5 µL من محلول كبريتات الصوديوم بتركيز 1.5 molar المسخن مسبقاً إلى الأنبوب الأول من محلول PEG، وامزج الأنبوب عن طريق سحب المحلول وإطلاقه بالماصة من ثلاث إلى خمس مرات. بعد المزج، سيتوزع تركيز الملح بالتساوي ويجب أن يصبح المحلول رائقاً.

ضع الأنبوب تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV light) وقم بعملية الربط التشابكي لمدة 30 ثانية. يجب أن تظهر طبقة غائمة فوق المحلول الذي يحتوي على الجيلات الدقيقة (micro gels). بعد ذلك، أضف 750 µL من محلول PBS إلى الأنبوب وامزج المحلول جيداً باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortexing).

بعد ذلك، يتم طرد الخليط مركزياً عند 4,000 ×g لمدة دقيقتين لتكوين ركازة. وبمجرد تكوين الركازة، يتم إزالة السائل الطافي مع الحرص على عدم تعكير الركازة، ثم تُعلّق الهلامات الدقيقة (micro gels) في محلول PBS طازج. تُغسل الهلامات الدقيقة خمس مرات إجمالاً باستخدام محلول PBS طازج، مع إجراء عملية الطرد المركزي لتكوين ركازة بين كل عملية غسيل وأخرى.

بعد الغسلة النهائية، يتم إزالة السائل الطافي ونقل 30 µL من الميكروجيل من الراسب إلى 1 mL من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، يتم تعريض محلول الميكروجيل للموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة ساعة واحدة بتردد 50 إلى 60 hertz وبقدرة 1.4 amps. بعد ذلك، يتم وضع 15 µL من محلول الميكروجيل على شريحة زجاجية نظيفة منحوتة بالحمض، ثم يتم وضع غطاء شريحة منحوت بالحمض رقم 1.5 في الأعلى.

اقلب الشريحة فوق منديل مختبري واضغط عليها برفق لإزالة المحلول الزائد ولضمان وجود الجسيمات الهلامية الدقيقة في طبقة واحدة. بعد ذلك، وباستخدام مجهر ضوئي، التقط عدة صور للجسيمات الهلامية الدقيقة باستخدام عدسة شيئية زيتية DIC 100x. قم بقياس الجسيمات الهلامية الدقيقة للحصول على قطر ممثل.

احسب مؤشر تشتت التعدد (poly dispersity index) باستخدام المعادلة القائمة على الحجم الموضحة هنا، حيث تمثل N العدد الإجمالي للجسيمات الهلامية الدقيقة (micro gels) وتمثل VI حجم الجسيم الهلامي الدقيق. ولقياس متوسط كثافة الجسيمات الهلامية الدقيقة، قم أولاً بتحضير محلول ديكسترين بتركيزات 7 و6 و5 و4 و3 و1% في ماء منزوع الأيونات، وكثافات محاليل الديكسترين موضحة هنا. بعد ذلك، أضف 2 milliliters من محلول الديكسترين بتركيز 7% إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، اسحب ببطء باستخدام الماصة 2 mL من محلول dextrin بتركيز 6% لتشكيل طبقة متميزة فوق محلول dextrin بتركيز 7%. وبعد خمس دقائق، أضف 2 mL من الطبقة التالية المكونة من dextrin بتركيز 5%، واستمر على هذا المنوال حتى يتم وضع كل تركيز من dextrin في طبقات وفقاً لترتيب تناقص تركيز dextrin. ثم ضع طبقة من micro gels بعناية فوق محلول dextrin بتركيز 1%، وقم بطرد التدرج مركزياً عند درجة حرارة 5 °C وبقوة 4,000 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بتصوير موقع الهلامات الدقيقة (micro gels) واحسب كثافتها وفقاً لموضعها بين الطبقات. ولقياس الكتلة المنتفخة للهلامات الدقيقة، قم أولاً بوزن أنبوب طرد مركزي دقيق وهو فارغ، ثم أضف إليه 1 mL من الهلامات الدقيقة. اغسل الهلامات الدقيقة خمس مرات بالماء منزوع الأيونات، مع إجراء عملية الغسل على فترات متتالية.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 4,000 ×g لترسيب المواد الهلامية الدقيقة (micro gels) بعد الغسلة الأخيرة. أعد تعليقها في ماء منزوع الأيونات واتركها تنتفخ لمدة لا تقل عن 48 ساعة. بعد مرور 48 ساعة، قم بطرد المواد الهلامية الدقيقة المنتفخة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 4,000 ×g، ثم قم بإزالة جميع السائل الطافي.

ثم قم بوزن العينة وتسجيل الكتلة الرطبة. بعد الحصول على وزن رطب دقيق، جمد الميكروجيلات عند درجة حرارة -80 °C، ثم قم بتجفيفها بالتجميد لإزالة الماء والحصول على الكتلة الجافة. وبمجرد تسامي جميع المياه، احسب محتوى الماء والبوليمر في الميكروجيلات باستخدام المعادلات الموضحة هنا، حيث يمثل MS الوزن الرطب للميكروجيلات ويمثل MD الوزن الجاف.

يوضح الشكل هنا متوسط قطر المواد الهلامية الدقيقة (micro gels) من PEG التي تم تكوينها باستخدام أوزان جزيئية مختلفة من 20%PEG. كما كان لزيادة وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) تأثير على قطر المواد الهلامية الدقيقة؛ فكلما زاد وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية، زادت أقطار التركيبات الثلاث الموضحة هنا.

انخفضت الكثافة المقاسة بواسطة تدرجات الديكسترين مع زيادة الوزن الجزيئي لجزيئات الـ peg السليفة. وقد تم تأكيد ذلك أيضًا في رسم بياني لنسبة المحتوى المائي، حيث وجد أن الـ peg ذو الوزن الجزيئي الأعلى يحتوي على كمية أكبر من الماء لكل جرام من البوليمر. وأخيرًا، ومن أجل إظهار إمكانية تحميل الميكروجيلات ببروتين مقترن فلوريًا، تمت إضافة ألبومين إلى الخليط قبل عملية البلمرة، حيث أصبح محاصرًا داخل الكرات.

أدت زيادة تركيزات البروتين المسمى فلورياً إلى زيادة مؤشر تشتت الحجم للكريات، بينما ظل متوسط الحجم ثابتاً. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تسخين جميع المحاليل إلى 37 درجة مئوية واستخدام جهاز الرج الدوامي (vortex) لخلط الهلامات الدقيقة جيداً من أجل تفتيت أي تجمعات أثناء غسل الشرائح وتجهيزها للتصوير. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية لتغليف الدواء للإجابة على تساؤلات أخرى تتعلق بتأثير تحرر الدواء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ميكروجيلات peg DA في ظروف معتدلة عن طريق تفاعلات الترسيب.